环状RNA疫苗协同增强体内泛CAR免疫疗法抗肿瘤效果的研究

本研究针对CAR-T细胞疗法在实体瘤治疗中面临的挑战，创新性地开发了基于环状RNA(circRNA)的体内泛CAR(panCAR)免疫疗法。研究人员通过免疫细胞趋向性脂质纳米颗粒(LNP)递送circRNA编码的CAR蛋白，成功在体内生成CAR-T/NK/Mφ细胞，显著抑制肿瘤生长并重塑肿瘤微环境(TME)。进一步结合circRNA疫苗(circRNAVAC)可协同增强抗肿瘤免疫，通过抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和抗体依赖性细胞吞噬(ADCP)效应显著提升疗效。该研究为肿瘤免疫治疗提供了新型"off-the-shelf"联合策略，发表于《Cell Reports Medicine》。

　　

肿瘤免疫治疗领域近年来取得重大突破，其中嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法在血液系统恶性肿瘤治疗中展现出显著疗效。然而，该疗法仍面临诸多挑战：制备过程耗时、成本高昂、需要淋巴清除预处理，以及可能引发细胞因子风暴等副作用。更令人困扰的是，CAR-T细胞在实体瘤中的治疗效果有限，这主要归因于免疫抑制性肿瘤微环境(TME)的存在和T细胞耗竭现象。如何开发更高效、更经济的免疫治疗策略，成为当前肿瘤治疗领域亟待解决的关键科学问题。

针对这些挑战，复旦大学基础医学院系统生物医学研究院前沿创新中心的研究团队创新性地将环状RNA(circRNA)技术与CAR免疫疗法相结合，开发了一种新型的体内泛CAR(panCAR)免疫治疗策略。研究人员首先优化设计了编码抗HER2 CAR蛋白的circRNA(circRNA^CAR)，发现其在免疫细胞中能实现比线性mRNA更持久高效的表达。通过特异性靶向免疫细胞的脂质纳米颗粒(LNP)递送系统，circRNA^CAR能在体内同时生成CAR-T细胞、CAR-NK细胞和CAR-巨噬细胞(CAR-Mφ)，形成"三管齐下"的抗肿瘤免疫攻击。研究进一步创新性地将circRNA^CAR与编码HER2抗原的circRNA疫苗(circRNA^VAC)联用，发现能显著增强抗肿瘤效果，这种协同作用主要通过抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和抗体依赖性细胞吞噬(ADCP)机制实现。该突破性研究成果发表在《Cell Reports Medicine》杂志上。

研究团队采用了多项关键技术方法：1)利用I型内含子自剪接策略构建高稳定性circRNA；2)开发免疫细胞趋向性脂质纳米颗粒(SORT-LNP)实现体内靶向递送；3)建立多种HER2阳性肿瘤小鼠模型评估疗效；4)采用流式细胞术和RNA测序分析肿瘤微环境变化；5)通过抗体耗竭实验验证NK细胞和巨噬细胞的关键作用。

研究结果部分的主要发现如下：

CircRNA^CAR高效表达CAR蛋白并介导显著的肿瘤杀伤
研究人员通过I型内含子自剪接策略成功构建了circRNA^CAR，Western blot和流式细胞术证实其在HEK293T细胞中高效表达CAR蛋白。与线性mRNA相比，circRNA^CAR在免疫细胞中表现出更持久稳定的表达特性。优化后的circRNA^CAR-opt-3在Jurkat细胞、THP-1细胞和人原代T细胞中均显示出最佳的CAR蛋白表达效率。体外杀伤实验证实，转染circRNA^CAR的免疫细胞能有效杀伤多种HER2阳性肿瘤细胞，且呈剂量依赖性。

巨噬细胞表现出circRNA^CAR诱导的高效肿瘤吞噬和促炎极化
研究发现circRNA^CAR转染的巨噬细胞能有效吞噬HER2阳性肿瘤细胞。流式细胞术显示circRNA^CAR诱导巨噬细胞向促炎M1型极化，表现为诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达上调而CD206表达仅轻微增加。RNA测序分析进一步证实circRNA^CAR显著上调巨噬细胞中与促炎功能、吞噬能力和免疫应答相关的基因表达。

免疫细胞趋向性脂质纳米颗粒高效递送circRNA至小鼠免疫细胞
研究人员筛选出能特异性靶向脾脏的LNP配方，其粒径约110nm，zeta电位约8mV。体内成像显示静脉注射的LNP-circRNA^Luciferase主要富集于脾脏。采用SORT策略的负电荷LNP同样显示出良好的脾脏靶向性。在Cre-loxP报告基因小鼠中证实，SORT-circRNA^Cre能有效递送至T细胞、NK细胞、巨噬细胞和树突状细胞。单次注射circRNA^CAR可在脾脏和淋巴结中形成持续72小时以上的体内panCAR细胞。

CircRNA^CAR有效抑制肿瘤生长并延长小鼠生存期
在CT26-HER2结肠癌模型中，静脉注射SORT-circRNA^CAR显著抑制肿瘤生长。瘤内注射LNP-circRNA^CAR同样显示出良好的抗肿瘤效果，能显著降低肿瘤负荷并延长生存期。在4T1乳腺癌和MC38-HER2结肠癌模型中，circRNA^CAR治疗甚至实现了肿瘤消退。

体内panCAR重塑肿瘤微环境至促炎状态
流式分析显示circRNA^CAR治疗显著增加脾脏和肿瘤组织中CD8⁺ T细胞、效应记忆T细胞(Tem)和中央记忆T细胞(Tcm)的比例，同时降低调节性T细胞(Treg)的比例。肿瘤组织中促炎M1型巨噬细胞(MHC II⁺)比例显著增加。H&E和免疫组化染色显示circRNA^CAR组肿瘤细胞死亡增加，CD8⁺ T细胞和CD86⁺细胞浸润增强。RNA测序发现circRNA^CAR上调了与T细胞增殖、树突细胞迁移、吞噬作用和促炎反应相关的基因通路。

CircRNA疫苗协同增强体内panCAR的抗肿瘤活性
研究人员设计了编码HER2抗原的circRNA疫苗(circRNA^VAC)，其含有内吞抑制基序(EPM)和ESCRT-ALIX结合区(EABR)以增强抗体产生。ELISA证实circRNA^VAC能诱导高滴度HER2特异性IgG抗体。在4T1-HER2、B16F10-HER2和MC38-HER2模型中，circRNA^CAR与circRNA^VAC联用显示出协同抗肿瘤效应，显著优于单药治疗。流式分析显示联合治疗组肿瘤中免疫细胞浸润增加，免疫抑制性细胞减少。

CircRNA^CAR增强circRNA疫苗诱导的抗体水平通过抗体介导的细胞毒性增强抗肿瘤活性
研究发现circRNA^CAR与circRNA^VAC联用能显著提高HER2特异性IgG及其亚型(IgG1、IgG2A、IgG2B、IgG2C)的抗体滴度。这些抗体能有效介导巨噬细胞的ADCC和ADCP效应。通过抗体耗竭实验证实，NK细胞或巨噬细胞的缺失会显著降低联合治疗的抗肿瘤效果。

这项研究具有重要的理论和应用价值：首先，创新性地将circRNA技术应用于CAR免疫治疗，克服了传统CAR-T疗法制备复杂、成本高昂的缺点；其次，开发的体内panCAR策略能同时调动适应性免疫(T细胞)和固有免疫(NK细胞、巨噬细胞)，为克服T细胞耗竭提供了新思路；最重要的是，circRNA疫苗与circRNA^CAR的协同作用机制揭示了抗体介导的免疫效应在肿瘤治疗中的关键作用，为联合免疫治疗策略的开发提供了新范式。该研究建立的体内panCAR-VAC协同免疫治疗框架，不仅为肿瘤治疗提供了新型"off-the-shelf"疗法，也为circRNA技术在生物医药领域的应用开辟了新方向。