灵芝多糖肽GL-PPSQ2完整N/O-糖肽的ZIC-HILIC富集与高分辨质谱解析及其糖基化修饰特征研究

本研究针对灵芝多糖肽GL-PPSQ2糖基化修饰不明确的科学问题，采用ZIC-HILIC富集结合nanoRPLC-ESI-MS/MS技术，首次系统鉴定了42个N-糖肽和338个O-糖肽的完整结构，揭示了其高异质性和核心糖型特征，为功能性食品开发提供了分子水平依据。

　　

在传统中药灵芝的活性成分研究中，多糖肽复合物GL-PPSQ₂因其显著的肠道保护作用备受关注。然而，这种由60.91%多糖和23.40%蛋白质组成的复合物，其糖基化修饰的"密码"始终未被破译——究竟是N-连接还是O-连接？糖链结构如何影响生物活性？这些问题制约着其药用价值的深度开发。更棘手的是，糖肽仅占蛋白酶解产物的2%-5%，且存在严重的信号抑制效应，传统分析方法难以捕捉这些"低调"的修饰信息。

福建农林大学的研究团队在《Microchemical Journal》发表的研究中，创新性地建立了ZIC-HILIC（亲水相互作用色谱）富集结合高能碰撞解离(HCD)质谱的技术路线。他们首先通过膜分离和凝胶色谱纯化获得纯度99.2%的GL-PPSQ₂，随后采用bottom-up（自下而上）策略进行蛋白酶解，利用ZIC-HILIC材料特异性捕获糖肽，最终在Orbitrap Fusion Lumos三合一质谱仪上实现完整糖肽的精准解析。

Proteomics identification of GL-PPSQ₂
研究团队鉴定出48种蛋白质，其中40种具有定量支持数据。值得注意的是，多数蛋白质仅通过单一肽段被识别，这可能与其低丰度表达或特殊结构相关。通过蛋白质互作网络分析，发现这些蛋白主要参与糖代谢和应激反应通路。

Glycoproteomic profiling
借助pGlyco软件，研究人员在35个N-糖基化位点上鉴定出42个完整N-糖肽，对应32种糖蛋白。GPSeeker则补充识别出4个具有典型N-糖核结构的糖肽。更惊人的发现来自O-糖基化分析：287个O-糖基化位点上的338个O-糖肽，展现出显著的微观和宏观异质性。糖链组成呈现高度多样性，包括高甘露糖型、复合型和杂合型等多种结构。

Conclusions
该研究首次绘制了GL-PPSQ₂的完整糖基化图谱，证实其同时存在N-和O-糖基化修饰。ZIC-HILIC技术对高甘露糖型和大分子量糖链的特异性富集优势得到验证。这些发现不仅为理解灵芝多糖肽的构效关系提供了分子基础，更建立了一套适用于复杂天然产物的糖肽分析标准流程。特别值得注意的是，O-糖基化的超乎预期的丰富程度，暗示其在调节GL-PPSQ₂生物活性中可能扮演关键角色，这为后续开发基于糖基化工程的功能性食品指明了方向。

这项由西藏那曲市科技计划（NQKJ-2024-20）和国家重点研发计划（2023YFD1600502）资助的研究，将传统中药活性成分解析推向了单糖基化位点的精度水平。Lin Dongmei（林冬梅）和Wang Saizhen（王赛珍）作为共同第一作者，在方法学创新和数据分析方面做出了突出贡献。研究团队特别强调，建立的标准操作流程可推广至其他药用真菌多糖肽的分析，对推动中药现代化具有示范意义。