冻干逆转录酶与聚合酶在SARS-CoV-2即时诊断中的开发与应用

这篇研究报道了一种基于自主制备的冻干（lyophilised）逆转录酶（MMLV RT）和Taq聚合酶的SARS-CoV-2即时检测（PoC）试剂盒。通过优化酶表达纯化工艺（His6-标签亲和层析）和冻干配方（含10%海藻糖和2% Ficoll 400），实现了无需冷链储存的高灵敏度检测（10 copies/μL RNA），并成功整合至脉冲控制扩增（PCA）便携设备Nano中，为资源有限地区提供分子诊断解决方案。

　　

1 引言

COVID-19大流行凸显了快速、低成本即时诊断技术的迫切需求。尽管抗原检测便捷，但灵敏度不足；而金标准RT-qPCR虽灵敏却依赖实验室设施。研究聚焦开发兼容便携设备（如Nano系统）的冻干扩增试剂，通过自主制备专利过期酶（MMLV RT、Taq/Klentaq聚合酶），突破商业试剂依赖性问题，解决冷链运输和甘油干扰等关键瓶颈。

2 实验方法

2.1 酶设计与表达

• Klentaq/Taq聚合酶：通过AlphaFold预测结构，N端引入His₆-标签和TEV酶切位点，Klentaq缺失5′–3′核酸外切酶活性但耐热性更优。
• MMLV RT：引入L139P/D200N等5个突变提升热稳定性，同样采用His₆-标签纯化策略。

2.2 蛋白纯化

• 两步纯化法：Ni-NTA亲和层析后，Klentaq/Taq经肝素柱精纯，MMLV RT通过阳离子交换柱，最终获得高纯度蛋白（SDS-PAGE验证），产量达3–4 mg/L培养液。

2.3 活性验证

• RT-qPCR测试：Klentaq（40 ng/μL）与MMLV RT（20 ng/μL）组合对50–5000 copies RNA的检测限与商业试剂（AptaTaq/LUNA）相当，Cq值差异≤2周期。
• PCA设备适配：在Nano系统中，自制酶组合可检测100 copies/μL，但冻干后灵敏度提升至10 copies/μL，反应时间缩短至20分钟。

2.4 冻干工艺优化

• 配方筛选：10%海藻糖+2% Ficoll 400的缓冲体系（20 mM Tris-HCl pH 8.3）保留Taq活性，残余水分5.3%，玻璃化转变温度（T_g′）为?5.7°C。
• 稳定性测试：真空包装冻干颗粒在室温储存4周后仍可检测5000 copies/rxn。

3 结果与讨论

3.1 酶性能对比
Klentaq在抑制剂耐受性上优于Taq，但后者因5′–3′外切酶活性更适合探针法检测。MMLV RT与自制聚合酶的协同效应显著，其Cq值较商业LUNA降低10个周期。

3.2 冻干试剂突破
冻干使试剂摆脱冷链限制，且溶解速度（1–5秒）优于商业冻干产品。DSC分析显示分解温度达214.3°C，证实热稳定性。

3.3 临床适用性
PCA技术与冻干试剂的结合，在Nano设备上实现与RT-qPCR相当的灵敏度，为家庭或野外场景提供可能。

4 结论

该研究建立了一套从酶设计、冻干到PoC设备整合的全流程方案，其开源特性可快速适配其他病原体检测，推动分子诊断在资源匮乏地区的普及。