细菌DNA滑动夹β-钳的配体结合动态变构效应及其在复制修复中的枢纽作用

这篇研究通过核磁共振（NMR）和氢氘交换质谱（HDX-MS）技术，揭示了细菌DNA滑动夹β-钳（β-clamp）在配体结合后引发的动态变构效应。研究发现，聚合酶IIIα亚基的短肽结合不仅局部稳定了β-钳的结合口袋，还通过独特的结合位点架构远程调控二聚体界面动力学，为理解这一DNA复制修复核心枢纽的多元功能提供了新视角。

　　

摘要

细菌DNA滑动夹β-钳作为复制修复的核心枢纽蛋白，其同源二聚体环状结构通过与多种蛋白质的短线性基序（SLiM）结合发挥作用。尽管其结构和功能已被广泛研究，但配体结合对其动态特性的影响尚不明确。本研究通过²H/¹³C/¹⁵N标记的β-钳核磁共振（NMR）谱图解析，结合氢氘交换质谱（HDX-MS），揭示了配体结合引发的全局动态变化。

结果

2.1 β-钳主链NMR谱图解析策略

通过氘代培养基表达83 kDa的β-钳二聚体，结合梯度优化CO去耦脉冲（GOODCOP）和β/α去耦脉冲（BADCOP）技术，实现了主链共振信号的指认。添加聚合酶IIIα亚基的八肽（pol III）后，谱图质量显著提升，最终完成306/346个¹⁵N-¹H信号的指认。

2.2 配体结合诱导β-钳的全局动态变化

化学位移扰动（CSP）分析显示，pol III结合主要影响β-钳的III结构域，但二级化学位移（SCS）表明其二级结构未改变。峰强度比和¹⁵N弛豫速率（R₂）证实，配体结合抑制了β-钳在高浓度下的自聚集倾向。

2.3 不同肽段结合的差异效应

比较pol III和pol IV（聚合酶IV肽段）的CSP发现，两者虽结合同一口袋，但pol IV对II-III结构域界面的扰动更强，而pol III更显著影响III结构域。突变修复蛋白MutL*的结合则因脯氨酸残基导致谱线展宽，提示非经典结合模式。

2.4 氢氘交换揭示多时间尺度动态性

HDX-MS显示，β-钳存在快速（秒级）和慢速（小时级）交换过程。pol III结合后，结合口袋附近的肽段（如359-366）在10秒内氘代率降低，而二聚体界面（如98-111）的氘代率反而增加，表明配体结合通过变构效应远程调控界面稳定性。

2.5 结合口袋甲硫氨酸氧化的功能影响

质谱鉴定发现，结合口袋内的Met362/Met364氧化会削弱pol III的结合亲和力，NMR谱中可见氧化与非氧化状态的共存峰，暗示氧化可能调控β-钳的伴侣选择。

2.6 配体稳定β-钳抵抗全局解折叠

尿素变性实验显示，pol III使β-钳完全解折叠的速率降低14.1%→11.6%/小时，脉冲标记实验进一步证实该过程不可逆。

讨论

β-钳的独特结合口袋由分散的残基构成（如Arg152-Val360跨200残基），这种架构允许配体结合能量通过动态变构传递至二聚体界面。与真核生物PCNA的对比表明，此类变构机制可能普遍存在于滑动夹蛋白家族。研究为理解β-钳如何通过结构可塑性协调多样伴侣蛋白提供了新范式，其氧化修饰的调控潜力值得进一步探索。