综述：从科学到虚构——连接冠状病毒多蛋白加工的体内与体外研究结果

这篇综述系统梳理了冠状病毒(CoVs)多蛋白加工(pp1a/pp1ab)和复制转录复合体(RTC)组装的研究进展，重点探讨了主蛋白酶(Mpro)、木瓜样蛋白酶(PLpro)的切割机制，以及超分辨显微镜、结构质谱等前沿技术在解析nsps动态过程中的应用，为抗病毒靶点开发提供了新视角。

　　

冠状病毒多蛋白加工的分子蓝图

冠状病毒家族（Coronaviridae）拥有RNA病毒中最大的基因组，其复制策略依赖于两个多蛋白前体pp1a和pp1ab的精确加工。这些巨型多蛋白（分别约490 kDa和749 kDa）通过病毒编码的蛋白酶进行时空特异性切割，释放出16个非结构蛋白(nsps)并组装成复制转录复合体(RTC)。这一高度调控的过程不仅是病毒增殖的核心，更是潜在的抗病毒靶标。

基因组布局与加工机制

病毒基因组ORF1a/b通过-1核糖体移码机制产生pp1a（nsp1-11）和pp1ab（nsp1-16）。两种病毒蛋白酶主导切割过程：位于nsp3的PL^pro负责nsp1-4位点，而具有半胱氨酸-组氨酸催化二元体的M^pro(nsp5)处理其余位点。值得注意的是，切割位点CS8/9虽在肽段实验中表现低效，但基因敲除实验证明其对于病毒存活至关重要，揭示了体外与体内研究的差异性。

技术革命推动认知突破

现代生物物理技术的融合为解析多蛋白加工提供了多维视角：

• 荧光共振能量转移(FRET)平台比较了SARS-CoV-2所有11个M^pro切割位点效率，显示nsp7-11区域的切割顺序为CS9/10 > CS7/8 > CS8/9 > CS10/11

• 原生质谱(Native MS)捕获到瞬态中间体，发现CS10/11在完整蛋白环境中反而成为最快切割位点

• 氢氘交换质谱(HDX-MS)结合计算建模揭示CS7/8形成α螺旋导致加工延迟，确保nsp7/8作为RdRP辅助因子适时释放

RTC组装的未解之谜

冷冻电镜(cryo-EM)已解析核心RTC结构（nsp12-nsp7-nsp8），但全长复合体组成仍存争议。最新原子模型提出以nsp15六聚体为中心的4.7 MDa超结构，包含6拷贝nsps和12拷贝nsp8/10。冷冻电子断层扫描(cryo-ET)则发现nsp3在双膜囊泡(DMV)上形成跨膜孔道，可能是RNA输出的通道。这些发现凸显了膜结合RTC与可溶RTC可能存在的功能分工。

未来技术前沿

突破当前局限需要技术创新：

• N端组学可追踪体内加工中间体

• 微流控质谱将提升低丰度蛋白检测灵敏度

• 原位冷冻相关显微术有望捕捉DMV-RTC的纳米级动态

• 在线快速光化学氧化(FPOP)结合Omnitrap多级质谱可实现构象变化实时监测

从基础研究到临床应用

对多蛋白时空调控的理解已催生抗病毒策略：M^pro抑制剂如奈玛特韦通过阻断切割抑制病毒复制。而对nsp14/nsp10复合体介导的mRNA加帽机制的解析，则为广谱抗冠状病毒药物设计指明新方向。随着技术进步，靶向RTC组装界面或调控切割顺序的变构抑制剂可能成为下一代抗病毒利器。

知识缺口与展望

领域内仍存在关键问题：全长多蛋白的折叠如何影响切割顺序？不同nsps的化学计量是否随感染阶段变化？N蛋白如何协调RTC功能？解答这些问题需要发展原位捕获技术，并整合时间分辨的体内外研究方法。正如作者强调，只有持续 bridging体外精确生化与体内复杂环境，才能完整描绘冠状病毒复制的分子图景。