基于rVAR2标记和磁性单细胞分选的循环肿瘤细胞转录组完整性保护新策略

本研究针对传统循环肿瘤细胞(CTC)检测方法因细胞透化导致mRNA完整性受损的问题，开发了结合重组VAR2CSA(rVAR2)表面标记与磁性单细胞分选的新技术。荷兰特文特大学团队通过对比四种肺癌细胞系验证显示，该技术使GAPDH和EpCAM基因的mRNA得率较CellSearch方法提升10-100倍，为单细胞转录组分析和个体化治疗提供了更可靠的技术平台。

　　

在癌症研究领域，循环肿瘤细胞(CTC)就像血液中的"液态活检"信使，携带着肿瘤转移和药物敏感性的关键信息。然而科学家们长期面临一个棘手难题：传统检测方法需要破坏细胞膜进行胞内标记，导致珍贵的mRNA像漏气的轮胎一样迅速降解。特别是FDA批准的CellSearch系统，虽然能通过上皮细胞粘附分子(EpCAM)捕获CTC，但后续检测细胞角蛋白(CK)必须进行的透化步骤，使得单细胞转录组分析变得异常困难。

荷兰特文特大学(University of Twente)的研究团队独辟蹊径，从疟疾寄生虫的"作案工具"中获得灵感。他们发现恶性疟原虫用来锚定胎盘的特殊蛋白VAR2CSA，其重组版本rVAR2能特异性识别肿瘤细胞表面普遍存在的癌胚硫酸软骨素(ofCS)。这种"以毒攻毒"的策略无需透化细胞，为mRNA完整性保护提供了全新思路。

研究人员建立的技术路线包含三大核心技术：首先采用CellSearch Profile Kit进行EpCAM介导的免疫磁珠富集；随后用rVAR2替代传统CK染色进行表面标记；最后通过显微操作下的磁性微针实现单细胞精准分选。为验证效果，研究选取了NCI-H1563、NCI-H460等四种具有不同EpCAM/ofCS表达特征的肺癌细胞系，将其掺入健康志愿者血液模拟临床样本。

【rVAR2、EpCAM和panCK表达谱】

流式细胞术定量显示，四种细胞系的生物标记表达差异显著：NCI-H1563的ofCS表达量超百万分子/细胞，而EpCAM最低的NCI-H460仅157分子/细胞。这种差异特征为方法评估提供了理想模型。

【mRNA完整性比较】

通过设计梯度细胞数实验发现，rVAR2组仅损失44% GAPDH mRNA，而CellSearch组损失达99.6%。线性回归分析表明，在检测EpCAM基因时，rVAR2方法的灵敏度比传统方法高61.8倍，可在<10个细胞时仍保持有效信号。

【单细胞分选验证】

磁性微针分选后的单细胞qPCR结果显示，rVAR2组的Ct值较CellSearch组降低6.8(GAPDH)和3.7(EpCAM)个循环，相当于110倍和13倍的mRNA得率提升。尤为关键的是，NCI-H1792细胞的EpCAM转录本在CellSearch处理后完全无法检出，凸显了新方法的优势。

这项发表于《Talanta Open》的研究具有双重突破意义：在技术上，首次实现CTC从富集、鉴定到单细胞分选的全流程mRNA友好型处理；在临床应用上，ofCS作为广谱肿瘤标记物的特性，可克服EpCAM阴性CTC的检测盲区。研究人员特别指出，保持细胞活性的特性还为进一步的功能研究预留了空间，如药物敏感性测试或体外培养。

不过该技术目前仍存在自动化程度不足的局限，作者建议未来可结合微流控平台提高通量。值得关注的是，虽然ofCS在正常组织表达极少，但在某些病理状态下可能出现假阳性，这提示临床转化时需建立更完善的特异性评价体系。总体而言，这项研究为肿瘤液体活检提供了更精准的"分子听诊器"，使科学家能倾听到单个CTC更完整的基因表达"心声"。