光防护新策略：层状硅酸盐衍生物的制备与评估及其作为防晒剂的应用研究

本综述系统探讨了利用新型方法学（NAMs）开发层状硅酸盐衍生物（如Viscogel系列）与有机防晒剂（如OMC、DHHB、BEMT）的纳米复合物，通过酵母模型（Saccharomyces cerevisiae）评估其光防护效能与安全性，证实S4+OMC-NC纳米复合物在提升细胞存活率的同时展现抗突变特性，为安全高效防晒制剂的设计提供新思路。

　　

引言

紫外线辐射对人类健康的影响已成为全球关注的焦点。到达地球表面的紫外线中，UVA（315–400 nm）占比约95%，UVB（280–315 nm）约占5%，而UVC（100–280 nm）则被大气层完全吸收。这些辐射可引起RNA和DNA的直接损伤、脂质氧化及自由基产生，进而导致晒伤、免疫抑制、光老化和光致癌。太阳能模拟光源（SSL）能够模拟自然日光中的UVA和UVB比例，避免季节变化对辐照度的影响。

紫外线对DNA的损伤形式多样，包括环丁烷嘧啶二聚体（CPDs）、嘧啶（6-4）嘧啶酮（6-4PPs）等光产物的形成，以及8-氧代鸟嘌呤（8-oxoG）、胸腺嘧啶二醇等氧化损伤。细胞通过碱基切除修复（BER）、核苷酸切除修复（NER）等机制应对这些损伤，但修复失败或错误修复可能导致突变、致癌或细胞死亡。RNA同样会受到紫外线伤害，影响基因表达，可能导致非功能性蛋白的产生，进而促进细胞衰老或黑色素瘤发展。

此外，紫外线辐射会产生活性氧物种（ROS），引起DNA单链断裂，若邻近另一处ROS诱导的损伤，则可能形成双链断裂。因此，光防护至关重要。目前防晒剂主要分为吸收紫外线的有机防晒剂和反射/散射紫外线的无机防晒剂，均属于被动防护。近年来，主动作用的防晒剂逐渐受到关注，它们不仅能吸收、反射或消散辐射，还能中和自由基。

纳米技术在光防护中的应用日益增多，其优势包括提高防晒剂的附着性和接触表面积。例如，蒙脱石（MMT）粘土或其钠盐形式（Na⁺ MMT）具有良好的离子交换能力，可与有机化合物反应。通过季铵盐插层反应获得的亲有机粘土，如Viscogel S4?（VS4）、Viscogel S7?（VS7）和Viscogel B8?（VB8），分别用[双（氢化牛脂烷基）二甲基铵]、[二甲基苄基氢化牛脂铵]和[双（氢化牛脂烷基）二甲基铵-2-丙醇（10%）]替换层间Na⁺。

Viscogel系列有机粘土因其分子结构可容纳其他有机成分（尤其是有机防晒剂）而受到研究关注。二乙氨基羟基苯甲酰己基苯甲酸酯（DHHB，商品名Uvinul? A）主要吸收UVA区域（约345 nm），甲氧基肉桂酸辛酯（OMC）主要吸收UVB区域（280–310 nm），而双-乙基己氧苯酚甲氧苯基三嗪（BEMT，商品名Tinosorb? S）作为高分子量合成分子，具有广谱吸收特性（290–400 nm），覆盖UVA和UVB区域。

有机与无机防晒剂的组合可提升光防护品质。例如，掺杂二氧化钛（TiO₂ dop.）的介孔二氧化硅既含有高效无机过滤器TiO₂，其介孔结构又能存储有机过滤器等活性成分。

当前，动物试验的使用逐渐减少，新方法学（NAMs）受到鼓励。NAMs指任何能够提供化学风险信息且无需动物实验的技术、方法或方法组合，包括计算机（in silico）、体外（in vitro）和离体（ex vivo）实验。

酵母（Saccharomyces cerevisiae）作为一种真核单细胞微生物，拥有多种突变株系，可用于评估太阳辐射的毒性、致突变性和基因毒性，以及防晒成分的光防护效果。突变株Ogg1缺乏OGG1基因，该基因负责通过碱基切除机制修复8-羟基-2′-脱氧鸟苷（8-OhdG）等紫外线引起的损伤。该菌株对氧化应激敏感，在光防护研究和光致突变过程中具有高度生物相关性。

材料与方法

本研究选用了Viscogel S4?、S7?、B8?（购自Bentec公司）和掺杂钛的介孔二氧化硅（TiO₂ dop.，Sigma-Aldrich）。有机防晒剂DHHB、OMC和BEMT购自Fagron公司，聚山梨酯80和刀豆氨酸购自Sigma-Aldrich。

光防护和抗光致突变潜力评估采用了NAM方法。使用Ogg1突变株（CD138），该菌株源于S. cerevisiae野生型FF18733，对精氨酸原养。酵母在YPD培养基中30°C震荡培养24小时，然后转接至另一10 mL YPD中，30°C震荡培养48小时至稳定期。培养物经188 g离心5分钟，重复3次，重悬于10 mL无菌水中。调整细胞密度至10⁷ cells mL^?1（OD₆₀₀=1）。取等分细胞，加入100 μg mL^?1各物质或混合物，涂布于YPD固体培养基（存活评估）或YNBD固体培养基（含60 mg L^?1刀豆氨酸，突变测试）。处理在黑暗中进行（评估无照射下的细胞毒性或致突变性）或SSL照射下进行。

黑暗条件下，细胞密度10⁷ cells mL^?1的烧瓶暴露于100 μg mL^?1各材料（无菌水中），30°C震荡6小时，每小时取样涂布。

SSL照射使用太阳能模拟器（Oriel Model 91192-1000，Newport Corp.，美国），发射21.7 J m^?2 s^?1 UVA和1.58 J m^?2 s^?1 UVB。处理采用递增SSL剂量：0 kJ m^?2（0′00″）、2.5 kJ m^?2（34′42″）、3 kJ m^?2（41′39″）、4 kJ m^?2（55′35″）、5 kJ m^?2（1 h 9′25″）、7 kJ m^?2（1 h 44′9″）和10 kJ m^?2（2 h 18′52″）。每次剂量后取样，稀释涂布于YPD培养基。30°C培养约4天后计数菌落。所有实验重复三次，结果以平均值±标准偏差表示。突变测试仅在37%致死剂量（DL₃₇）下评估，该剂量基于统计计算，保证每个细胞平均遭受一次致死打击。

插层OMC纳米复合物（NC）及其物理混合物（PM）的制备采用溶液插层法，比例2:1（OMC:粘土）。首先将亲有机粘土分散于甲醇中，磁力搅拌30分钟。然后将过滤器溶解于同一溶剂，搅拌至完全溶解，加入粘土分散液，60°C回流搅拌72小时。之后混合物0–8°C储存24小时。离心（8073 g，15°C，1小时），上清液收集于100 mL容量瓶。NC用甲醇洗涤3次，上清液合并。插层产率通过UV-Vis分光光度法（311 nm）间接计算。沉淀物冻干储存用于表征测试。NC制备重复三次。

PM按相同比例（过滤器:粘土或TiO₂ dop.）在玻璃板上滴加甲醇混合，50°C干燥约2小时，储存用于表征。

原材料及其PM作为阴性对照评估NC形成。粉末X射线衍射（PXRD）使用Shimadzu XRD 6100衍射仪（40 kV，30 mA），衍射角2θ范围2–60°，室温下使用CuKα波长（1.542 ?）作为X射线源。布拉格方程用于测量基面间距。傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析使用Shimadzu IR-21 Prestige光谱仪，样品（1.0% w/w）制备于KBr盘。热重分析（TGA）使用Shimadzu TGA-60热分析仪，氮气流速50 mL min^?1，温度范围30–500°C，升温速率10°C min^?1。差示扫描量热（DSC）分析使用Shimadzu DSC-60热分析仪，样品置于40 μL密封铝坩埚，扫描范围25–350°C，扫描速率10°C min^?1，氮气流速50 mL min^?1。动态光散射（DLS）测定粒径分布，使用Malvern Mastersizer 2000/2000E粒径分析仪。样品（VS4、VS7、VB8和TiO₂ dop.）预先分散于20 mL 0.1% (w/v) 聚山梨酯80水溶液中，超声10分钟分散颗粒。分析重复三次，结果以平均值±标准偏差表示。

结果使用GraphPad Prism软件（版本8.0.2）进行统计分析，至少三次独立实验。非参数分布数据（如存活分析和直接突变-Can^R）采用ANOVA检验，继以Kruskal-Wallis检验，比较结果平均值和标准偏差，显著性差异设定为p < 0.05。

结果与讨论

层状结构与过滤剂按供应状态的细胞毒性和致突变性特征

将防晒剂插入纳米尺寸系统可为衍生配方带来多种益处，不仅增加活性成分稳定性，还提高配方附着性和光吸收效率。纳米尺寸增大了表面接触面积，使单位重量颗粒数增加，从而改善这些纳米结构的物理化学性质。

然而，随着防晒配方商业供应的扩大，且这些防晒过滤器需停留在皮肤表面而非渗透入系统循环，对其透皮吸收相关的潜在毒性和有害自由基的产生存在担忧。如本研究所示，将光防护剂插层于亲有机粘土中，不仅通过稳定这些物质防止自由基形成，还因粘土外亲水表面防止透皮吸收。

这些新型纳米复合材料的光毒理学评估对其确保有效性和安全性至关重要。本研究制备了这些新型光防护纳米复合材料，探索了不同硅酸盐类型（如Viscogel衍生物）层状结构的反应性以及介孔二氧化硅的孔隙。每种预形成的硅酸盐层状结构在与化学防晒剂插层前被分离，并在黑暗条件下测试其对Ogg1菌株的细胞毒性和致突变性特征。该菌株对VS4、VB8和TiO₂ dop.样品不敏感。但VS7样品对酵母有毒性，存活分数下降（p < 0.05）。VS7的细胞毒性可归因于其烷基铵化学结构中芳香环的存在，可能加速Ogg1菌株的细胞死亡机制。

酵母作为真核模型，拥有与人类正交的遗传物质，可作为稳健高效的体外筛选测试，揭示配方活性成分的自发毒性或非毒性反应。就无任何照射下的致突变性而言，VS7和TiO₂ dop.无致突变性，其突变频率与VB8统计相当；相反，VB8显示突变子频率增加（p < 0.05），表明黑暗条件下的致突变效应。因此，VS7和VB8均因细胞毒性和致突变效应被排除作为有机防晒剂插层候选。相比之下，VS4在评估产生的突变子频率时，与对照（CD138）相比具有抗突变性（p < 0.05）。并行地，选用于层状硅酸盐插层过程的有机过滤剂对酵母无显著毒性效应，但相同黑暗条件下，仅BEMT具有致突变性（p < 0.05）。OMC的细胞毒性和致突变性已在先前工作中证实，因此未在此初始阶段测试。

层状结构与过滤剂经SSL照射处理后的细胞毒性和致突变性特征

存在SSL照射时，所选层状结构（VS4和TiO₂ dop.）具有光防护性，增加细胞存活分数（p < 0.05）。这种光防护作用得益于这些结构的层状或管状包装对UV辐射的物理屏障。

本研究中使用有机过滤剂（DHHB、OMC和BEMT）也观察到存活率增加。它们保护酵母细胞免受太阳能模拟器发射辐射的毒性效应。过滤剂的光防护作用源于其辐射吸收机制并以热量形式释放，DHHB作用于UVA范围，OMC作用于UVB范围（兼有少量UVA吸收），BEMT作为大分子量过滤剂吸收UVA和UVB。此外，DHHB在暴露约2小时后显示光降解，因此重申了混合过滤剂和重新施用光防护配方以提高其效力的必要性。

就致突变效应而言，所选层状硅酸盐结构（VS4和TiO₂ dop.）的诱导突变水平与对照相当（p > 0.05），即在光遗传毒性方面，这些结构无致突变性且无抗突变性。此结果也在使用DHHB和OMC过滤剂时观察到。然而，与研究中的其他过滤剂相反，BEMT被证明具有光致突变性，因其显著增加突变子频率（p < 0.05），从而排除了其在VS4中插层的可能性。此突变子频率增加可解释为BEMT过滤剂化学结构中高数量反应点，能够产生多种氧化中间体，负责增加突变。

因此，由于VS4的层状结构和OMC化学防晒剂所显示的光防护作用和安全性（其中OMC的安全性已被广泛研究），即使OMC对UVA范围贡献较小，仍选择VS4和OMC用于纳米复合材料制备。

S4/OMC-纳米复合材料及其相应物理混合物的表征

插层过程最终产物的上清液用于通过UV-Vis分光光度法间接测量插层产率。从初始质量约0.8 g OMC每0.4 g VS4开始，稀释后上清液显示产率约34.23%。此产率优于Shen等人所述，其插层聚乙烯氧化物（PEO）于MMT Na+中产率为28%。

有机粘土、PM和NC在微米尺度上显示单峰分布。这些尺寸是不同层状单元聚集的结果，这些单元在物理分层过程或溶剂作用后产生纳米尺寸系统。然而，Viscogel衍生物在不同有机溶剂和可掺入配方中解聚为纳米结构。用于此分析的溶剂是添加0.1% w/v聚山梨酯80的蒸馏水，这是未揭示其纳米尺度的主要原因。然而，TiO₂ dop.颗粒最初在水介质中显示微米尺寸，在甲苯和肉豆蔻酸异丙酯中溶解时未显示再生纳米系统的可能性，因此被排除作为插层化学防晒剂的纳米复合材料选项。

制备PM时不给予试剂足够接触时间以观察插层。Paiva等人曾描述化学防晒剂插入钠蒙脱石中，当反应产率与本工作观察值相符时。但该方法限于可电离且溶于酸性水溶液的化学过滤剂。获得新系统的证据通过表征技术确认，如下所述。

比较而言，VS4按供应状态和插层产物的TGA结果未显示样品稳定性变化，因为质量损失发生在单一时间点，大约相同温度范围，且随后延长的稳定阶段相当。观察到的质量损失与纯材料的烷基铵离子和OMC有机过滤剂有关，因为损失质量百分比是插层过程所得产率和烷基铵含量的结果。至于物理混合物，TGA分析显示样品显著质量损失，72.319%仅与VS4的烷基铵离子有关。为补充TGA所得信息，DSC分析显示VS4按供应状态存在吸热事件，初始温度达100°C，在插层产物中几乎不出现。这是由于存在于VS4按供应状态层间空间的大量水粒子被移除。此初始数据可能指示插层过程后新产物的形成，因为插层材料降低了水在层间空间容纳的被动性。如在插层产物分析中，这些混合物的TGA分析通过DSC分析中吸热事件的出现得到补充，确认新系统的实现。TGA和DSC技术显示纳米复合材料与物理混合物之间的显著差异。由于形成的物理混合物呈糊状，未用于XRPD和FTIR分析。

不同地，XRPD分析显示插层样品中出现另一个峰，左移，代表层间空间中OMC的存在（未出现在VS4按供应状态中）。在此峰（2θ = 4.43°）处，应用布拉格定律计算的层间间距（d = 20.35 ?）高于VS4按供应状态最高峰（2θ = 7.6°）的层间间距（d = 11.63 ?）；即OMC插入层间空间内部，起源一种插层纳米复合材料，可能以单层形式定向。

FTIR分析未清晰显示VS4按供应状态与插层产物之间的显著差异，因为VS4的谱带大于OMC的谱带。因此，该技术检测新形成系统效果不佳。然而，插层产物在1750和1463 cm^?1附近存在轻微差异，可能分别对应OMC的C=O基团拉伸及其芳香环的C=C基团，如Daneluti等人和Wu等人所记录，从而确认插层产物中此过滤剂的存在。

S4/OMC-纳米复合材料及其相应物理混合物的细胞毒性和致突变性特征

酵母细胞挑战插层产物和/或制备的物理混合物以确定细胞存活和突变。这些结果在此时被认为有趣，因为即使在黑暗中有致突变效应，所有样品证明对我们的细胞模型无毒性，因此需要模拟日光（SSL）下这些行为的调查。有趣地，当使用纳米复合材料和/或物理混合物样品面对SSL时，观察到对酵母菌株的光防护效应。即，与对照（仅菌株无任何样品）相比，它们在所有处理点增加细胞对UVA-UVB辐射效应的保护（p < 0.05）。此光防护归因于这些样品中光防护活性成分的存在，主要是OMC吸收或反射或分散这些辐射。此外，VS4通过提供对抗这些辐射的纯物理屏障贡献于此光防护，允许更大反射或分散给定其高接触表面和单位重量大量颗粒。

NC和/或PM组保护细胞对抗由紫外线辐射来自SSL诱导的CPDs和6-4PPs光产物的细胞毒性效应。细胞存活在所有样品中约1小时暴露SSL后开始下降，可能因为细胞攻击不仅由辐射本身开始，还由这些辐射产生的产物如活性氧物种（ROS），此外过量DNA修复和链断裂。有科学研究证明由太阳能模拟器发射的UV辐射与纳米尺寸活性成分如OMC接触产生一系列活性氧物种（ROS）如超氧阴离子自由基（O₂^?）、过氧化氢（H₂O₂）、单线态氧（¹O₂）和经由Fenton反应或类似反应的^?OH，在DNA损伤中起重要作用并导致细胞毒性。即使有修复机制应对氧化应激，高水平DNA损伤的细胞可能饱和。这些DNA损伤可能导致同源重组，过程中可能在DNA中产生单链断裂，在修复饱和情况下，可能最终由Ogg1酶同时修复行动引入双链断裂。这证明细胞致死性经常观察，如我们的情况，在剂量超过1小时。然而，在较低SSL剂量下，Ogg1酶可能对细胞存活必要，避免链断裂的出现。

物理混合物在最后处理点显示比纳米复合材料更好的光防护性能。但此混合物，好奇地，既不更有效也非细胞毒性。总体，混合物和/或纳米复合材料颗粒对UV辐射的反射或吸收比吸收及随之产生的ROS或其他对细胞攻击更重要。

在光致突变方面，观察到所有样品均无光致突变性；即它们全部导致突变频率减少。与对照相比，此减少在纳米复合材料中显著（p < 0.05），赋予这些关联抗光致突变特性。虽然这些样品中过滤剂可作为对抗UV辐射的生色团，增加ROS形成，但它们在S4有机粘土结构中的存在证明有用于减弱这些过滤剂在SSL存在下的致突变效应。

当彼此分析时，NC显示比PM更大的抗光致突变效应，因为两样品间存在统计显著差异。这些结果证明这些样品的光防护和抗光致突变效应，并 corroborate Paiva等人报告的科学研究所证明当它们分析TiO₂和辛基二甲基-PABA（ODP）与粘土关联时。这些结果强化先前关于良好光防护配方的言论；有必要保证效率与安全，通常通过无机和有机过滤剂组合获得，此外关联其他具有光防护活性的成分如有机粘土和抗氧化剂。

在此意义上，本工作测试的材料涉及有机过滤剂如OMC和层状硅酸盐结构，也认可用于光防护活动。此处，从OMC插层于有机粘土VS4获得的纳米复合材料更有效，无论在光防护方面，提供细胞的光防护效力，还是在致突变性方面，展示更重要的抗光致突变活性相比其他组合。

结论

本工作中，我们的结果显示，在所研究层状结构中，VS4是光防护的有前途候选，因为增加细胞对SSL的存活，即使未减少突变。然而，在OMC插层入VS4及其相应物理混合物后，S4/OMC-NC显示比VS4按供应状态更有前途，在效力（增加存活）和安全（减少突变频率）方面。因此，S4/OMC-NC被识别为光防护的最佳候选，因为它确保细胞保护结合抗突变效应在SSL上，使能新有效安全光防护配方制备的前景。