辅助染色体AC12调控香蕉枯萎病菌热带4号生理小种（TR4）毒力的机制研究

本研究发现香蕉枯萎病菌热带4号生理小种（TR4）的辅助染色体AC12对其毒力具有重要贡献。通过实验诱导AC12缺失，发现突变体在香蕉植株上的致病性显著降低，同时伴随核心染色体结构重排。该研究揭示了AC12在病原菌适应性进化中的作用，为防控香蕉枯萎病提供了新的分子靶点（effector genes）和理论依据。

　　

辅助染色体AC12对香蕉枯萎病菌热带4号生理小种毒力的贡献研究

1 引言

丝状真菌进化出区室化的基因组结构，包含保守的核心区域和动态的辅助区域，这些区域被认为驱动病原体对变化环境的适应性，包括与宿主的相互作用。热带4号生理小种（Tropical Race 4, TR4）是感染香蕉的镰刀菌（Fusarium spp.）谱系，对工业香蕉品种卡文迪什（Cavendish）造成毁灭性的枯萎病流行。近期研究表明，TR4含有一条辅助染色体（染色体12），在某些菌株中经历了广泛的内部重复，其大小比其他密切相关的菌株增加了三倍。然而，该辅助染色体对毒力的贡献目前尚不清楚。

2 结果

2.1 辅助染色体12对营养生长非必需

为研究TR4参考菌株II5中AC12的功能，通过用苯菌灵处理插入了潮霉素抗性盒的II5:ΔSIX13转化体，获得了7个独立丧失潮霉素抗性的菌落。AC12的缺失最初通过AC12特异性引物的PCR确认，基因组测序和短读段比对进一步证实了所有7个突变体中AC12的完全缺失。重要的是，苯菌灵处理后未检测到其他大规模缺失，除了AC12完全缺失外，读段比对与野生型菌株相似。轮廓钳位均匀电场（CHEF）电泳和AC12特异性探针的Southern印迹分析证实了三个测试突变体菌株中缺乏约3.5 Mb的染色体条带，这与TR4参考菌株II5中AC12的预期大小一致。AC12缺失突变体在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）平板上的生长与亲本菌株相似，表明在这些条件下AC12对营养生长非必需。此外，AC12的缺失不影响与II5的营养相容性，如II5菌株和AC12缺失突变体7.2的硝酸盐利用缺陷（nit）突变体之间形成稳定异核体的能力所示。

2.2 苯菌灵处理引发核心染色体的染色体间重排

除AC12缺失外，CHEF凝胶分析揭示了额外的核型差异，尤其在突变体7.2中，核心染色体电泳核型显示明显变化。由于测序未检测到AC12以外的其他遗传物质的大规模缺失，推测该突变体中观察到的染色体大小差异可能是染色体间易位的结果。基于短读段测序数据的基因组组装进一步分析发现了若干结构变化，包括小缺失（每个突变体6-12个缺失）和易位（每个突变体4-10个重排）。最值得注意的是，7个突变体中的5个显示了染色体7和8之间的染色体间重排。此外，在突变体7.3中检测到染色体1和2之间的重排；在突变体7.2中检测到染色体5和6之间的重排；在突变体10.1中检测到染色体6和7之间的重排。突变体7.2中染色体5和6之间的重排通过染色体特异性引物的PCR独立确认。这些核心染色体之间的染色体间重排均未引起PDA平板上营养生长可检测的缺陷。总之，这些结果表明，苯菌灵处理除了导致TR4菌株II5中AC12的缺失外，还引发了核心染色体之间的染色体间重排，并强调这些结构变化均不影响真菌的营养生长。

一些辅助染色体可以通过营养菌丝融合在不同F. oxysporum菌株之间水平转移。尝试将携带潮霉素抗性盒的AC12从菌株II5转移至 race 1参考菌株CR1.1或非致病性F. oxysporum菌株Fo47（两者均携带诺尔丝菌素抗性） during co-cultivation（测试30个平板）未能产生双抗性后代，表明该辅助染色体缺乏水平转移。

2.3 辅助染色体12有助于高渗和细胞壁胁迫耐受性

位于AC12上的若干基因预测功能与不同环境胁迫（如高渗透压或细胞壁胁迫）的耐受性相关。例如，基因12g01480与MSN1相关，另注释为高渗透压诱导转录蛋白（Genbank: EMT69250.1）。类似地，基因12g01620（NCBI: XP_031052124）与MTL1相关。为测试AC12的缺失或染色体内重复是否影响胁迫响应，将菌株II5（染色体内重复）、M1（无重复）或三个AC12缺失突变体（无AC12）在不同胁迫条件下生长。AC12的缺失不影响单独基本培养基或补充甘油或甲萘醌的生长。然而，在高盐浓度（0.8 M NaCl）或存在细胞壁胁迫剂刚果红的情况下，AC12突变体的生长略微减少。类似地，与II5相比，菌株M1在刚果红存在下显示略微减少的生长，这可能是AC12基因剂量较低或其他存在-缺失变异的结果。M1和AC12突变体在含刚果红的培养基中均显示比II5更光滑的菌落边缘。总体而言，这些结果表明AC12在不同环境胁迫因子的耐受性中扮演角色，尽管较小。

2.4 辅助染色体12有助于TR4对香蕉植株的毒力

为确定AC12在TR4对香蕉毒力中的作用，用亲本菌株II5或三个AC12缺失突变体接种卡文迪什品种植株。接种十周后，接种AC12缺失突变体的植株球茎坏死程度显著低于接种亲本菌株的植株。尽管突变体仍能感染卡文迪什，但球茎坏死的平均严重度为48.9%，而亲本为95%。重要的是，用苯菌灵处理未丢失AC12的菌株引起与亲本菌株相似的球茎坏死水平。此外，接种II5或M1的植株枯萎症状更严重且发展更快于接种AC12缺失突变体的植株。

编码在辅助区域上的分泌效应子可作为TR4对抗香蕉的毒力因子。然而，某些效应子基因的研究受到以下事实的阻碍：它们在与染色体1连接的辅助区域和AC12上存在的分段重复中以多个拷贝存在。因此，缺乏AC12的突变体的可获得性通过敲除染色体1辅助区域上剩余的单个基因拷贝 facilitated these effectors的遗传分析。获得了两个编码在染色体1辅助区域定位的植物体内上调效应子候选基因1g02190的独立敲除突变体。这些突变体在ΔAC12背景中生成，该背景已缺乏位于AC12上的1g02190拷贝（ΔAC12Δ1g02190-1和ΔAC12Δ1g02190-2）。这些敲除突变体未显示与ΔAC12突变体相比毒力的额外减少，表明效应子1g02190对毒力非必需。另一方面，将12g00300（唯一编码在AC12上的植物体内上调效应子基因）异位重新引入ΔAC12缺失突变体并未显著增加球茎坏死和枯萎症状水平与ΔAC12突变体相比。最后，菌株M1（无AC12染色体内重复）和II5（AC12染色体内重复）毒力相同，表明AC12的染色体内重复在温室条件下不影响毒力。

3 讨论

基因组区室化为核心和辅助区域发生在许多丝状真菌病原体中。辅助基因组区域显示与核心基因组相比更高的遗传变异，认为有助于快速适应，并通常包含对宿主感染重要的效应子基因。在不同的F. oxysporum病理系统中，辅助区域赋予宿主特异性毒力，通过其将致病性水平转移至非致病性分离株的能力例证。

此处研究了香蕉感染TR4菌株II5中辅助染色体AC12的作用。缺乏完整AC12染色体的突变体的存活证明其对营养生长非必需，如先前在其他宿主植物感染的F. oxysporum菌株中显示的辅助染色体。重要的是，我们观察到接种AC12缺失突变体的香蕉植株疾病严重度显著减少，表明该辅助染色体在植物感染中的重要作用，类似于其他感染不同植物宿主的F. oxysporum菌株中的类似辅助染色体。此外，AC12可能具有超越毒力的更广泛作用，如AC12缺失突变体在高盐和细胞壁胁迫下生长略微受损所示，并考虑若干AC12编码基因（除效应子外）的预测功能。

与先前在其他F. oxysporum专化型中辅助染色体缺失突变体的报告对比，TR4的AC12缺失突变体仍能感染香蕉植株并引起特征性FWB症状，尽管严重度降低。这可通过分离株II5中存在附加辅助区域解释，该区域与核心染色体1连接并编码七个预测的SIX效应子同源物以及33个附加效应子候选者。此外，染色体1上的辅助区域和AC12共享许多重复，包括若干推定效应子基因。由于这些重复妨碍效应子候选者的敲除分析，新生成的AC12缺失突变体代表未来确定感染香蕉所需最小效应子集的有用工具，并促进使用抗性香蕉基因型搜索潜在无毒基因。为量化AC12和染色体1辅助区域的毒力贡献，我们在AC12缺失背景中功能分析了两个不同效应子基因。然而，染色体1上附加效应子基因的靶向敲除并未进一步减少AC12缺失突变体的毒力。类似地，将单个AC12特异性效应子基因重新引入缺失突变体对毒力无显著影响。由于AC12对TR4毒力的具体贡献显著，考虑到与染色体1辅助区域共享区域的程度，我们推测附加AC12编码基因（除效应子外）可能在染色体缺失突变体的毒力表型中扮演更突出角色。

除辅助染色体AC12的缺失外，若干突变体系显示核心染色体的染色体间重排。这些重排令人感兴趣，考虑到F. oxysporum菌株核心染色体之间通常观察到的高水平共线性。尽管染色体重排可对体外和体内产生强烈影响，我们在突变体中未观察到与这些核心染色体重排相关的表型差异。此外，菌株II5中的AC12包含大量重复，包括染色体大小的近三倍可能由于染色体内重复。我们未检测到TR4菌株II5和M1（携带或不携带AC12的染色体内重复）之间的生长速率或毒力显著差异。迄今，与AC12重复相关的明确适合度效应仍有待发现，因为携带或不携带重复的TR4菌株显示相似毒力水平。

总之，我们的结果确认了TR4参考菌株II5中独立辅助染色体AC12的染色体内重复的存在，并证明其在不同生物过程中的贡献，尤其是植物感染。观察到的染色体内重复和染色体重排指示高度基因组可塑性，突出真菌植物病原体中辅助染色体多样化的重要机制。这些适应对F. oxysporum毒力和/或生物学的影响仍有待确定。对TR4谱系中辅助区域功能和动力学的进一步知识将对抗击这种毁灭性香蕉病原体至关重要。

4 实验步骤

4.1 真菌生长条件和染色体缺失诱导

Fusarium oxysporum热带4号生理小种（TR4）菌株II5和M1以及新生成的II5突变体菌株常规在25°C马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）平板上培养。所有菌株的孢子悬浮液以甘油储存在-80°C。

如先前所述 with slight modifications诱导染色体缺失。将菌株II5:ΔSIX13在补充25 μg/mL苯菌灵的M100培养基中于150 rpm和25°C培养4天。通过两层无菌 cheesecloth过滤培养物获得分生孢子。将分生孢子涂布在补充0.04% Triton X-100的M100平板上。平板覆盖一片无菌滤纸并在25°C孵育2至3天。随后，将滤纸转移至含100 μg/mL潮霉素的PDA平板，在25°C孵育1天。之后，移除滤纸，通过与原始M100平板比较选择丧失潮霉素抗性的菌落。推定染色体缺失突变体转移至单独PDA平板供进一步验证。使用推定突变体的菌丝体，使用Phire Plant Direct PCR Master Mix（Thermo Scientific）进行AC12存在的PCR基因分型。使用五对引物（退火位点分布染色体全长）测试苯菌灵处理推定突变体中AC12的存在或缺失，并以菌株II5作为阳性对照。还通过PCR验证了菌株?AC12 7.2中染色体5和6之间的染色体重排。所用引物列于表S1。

4.2 水平染色体转移

通过共培养潮霉素抗性II5:ΔSIX13和诺尔丝菌素抗性 race 1菌株CR1.1或非致病性F. oxysporum菌株Fo47尝试AC12的水平转移如先前所述。简言之，将潮霉素抗性II5:ΔSIX13孢子以1:1比例与 race 1菌株CR1.1或Fo47的孢子（1×10⁵） spread on PDA plates。在25°C共培养7天后，收获孢子并用于接种含潮霉素（100 μg/mL）和诺尔丝菌素（50 μg/mL）的PDA平板。观察平板10天以形成双抗性菌落。

4.3 测序和序列分析

为验证苯菌灵处理生成的突变体缺失AC12并分析苯菌灵处理对其他基因组区域存在的影响，对七个AC12突变体进行测序。将突变体在马铃薯葡萄糖肉汤中于150 rpm和25°C生长4天以获得菌丝体。离心培养物，并 freeze-dried菌丝体。使用Masterpure Yeast DNA Purification Kit（LGC Biosearch Technologies）从freeze-dried菌丝体提取DNA。提取的DNA送北京基因组研究所进行Illumina全基因组重测序。使用BWA mem v. 0.7.17将读段比对至II5参考基因组组装。使用jvarkit v. 589510ae3的WGS coverage plotter可视化比对。

此外，使用SPAdes v. 3.13.0组装短读段。这些组装用于使用mummer v. 4分析结构变异，包括染色体重排，随后使用MUMandCO v. 3.8。AC12缺失突变体的组装统计注于表S2。

为确定位于AC12上基因的推定功能，使用eggnog mapper v. 2.1.12。使用effectorP v. 3 on the secretome determined by signalP v. 5识别推定效应子基因。基于使用blastP v. 2.14.0的Fol4287 SIX基因同源性搜索识别Secreted in Xylem（SIX）基因。

4.4 CHEF电泳和Southern印迹

如先前所述通过CHEF电泳和 subsequent Southern印迹分离所有菌株的染色体。

4.5 胁迫耐受性测试

基于功能基因注释，选择不同环境胁迫因子，并测定AC12突变体对这些不同环境胁迫因子的响应。为测试渗透胁迫响应，添加0.8 M NaCl或1.2 M甘油，而为响应活性氧物种或细胞壁胁迫，分别添加10 μg/mL甲萘醌或40 μg/mL刚果红。从甘油储液接种菌株II5、M1和选定突变体于PDA平板。随后，从菌落边缘取琼脂块置于常规PDA平板、MMA平板或补充0.8 M NaCl、1.2 M甘油、10 μg/mL甲萘醌或40 μg/mL刚果红的MMA上。在接种后3天（dpi）测量菌落直径。在5 dpi拍摄菌落照片。

4.6 营养相容性测试

使用氯化钾生成菌株II5和II5ΔAC12 7.2的nit突变体如先前所述进行营养相容性测试。生成的nit突变体在MMA平板上测试相容性，并观察菌落接触点形成密集菌丝生长（指示异核体形成）。

4.7 Fusarium转化

使用基于先前描述质粒的修饰CRISPR-Cas9载体进行转化。该质粒（CRISPR/Cas9-FoU6-FoNLSx2）包含附加H2B核定位信号（NLS）和优化gRNA支架。将靶序列克隆至载体和生成供体模板如先前所述进行。如所述 with modifications转化TR4参考菌株II5和II5 ΔAC12 6.4。如感染测定所述生成II5和一个AC12缺失突变体（II5 ΔAC12 6.4）的孢子。随后，使用500 μL孢子悬浮液接种50 mL Fries培养基，并在黑暗中和135 rpm、20°C下生长1天。新形成菌丝体使用IKA Ultra Turrax Tube Drive P control（IKA）以6000 rpm混合10秒。所有混合菌丝体用于接种200 mL新鲜Fries培养基，并在黑暗中和135 rpm、20°C下 overnight孵育。 overnight形成菌丝体通过一层尼龙网（20 μm）过滤，并用50 mL KC溶液（0.6 M KCl, 65 mM CaCl₂）洗涤三次。洗涤后菌丝体收集并用10 mL过滤灭菌原生质体酶 mix（含25 mg/mL来自Basidiomycetes sp.的driselase、5 mg/mL来自Trichoderma harzianum的lysing enzyme和100 μg/mL来自Trichoderma viride的chitinase，均购自Sigma-Aldrich）在KC中处理。酶 mix在28°C以缓慢摇动孵育2小时。通过一层尼龙网过滤将原生质体与菌丝体分离。原生质体在4°C以1800 g离心10分钟，并使用冰冷STC（1.2 M sorbitol, 10 mM Tris–HCl pH 8, 20 mM CaCl₂）洗涤两次。洗涤后，原生质体以每反应100 μL STC重悬。随后将原生质体与约15 μg Cas9质粒和15 μg供体模板以及100 μL 60% PEG溶液（聚乙二醇4000，溶于STC）混合。为敲除1g02190，组合两个不同gRNA质粒。混合物在室温下静置20分钟。原生质体用1 mL STC最终洗涤一次。通过混合与冷却RM（34.2% sucrose, 0.1% yeast extract, 0.8% agar）涂布原生质体。固化后，将补充50 μg/mL诺尔丝菌素的YG培养基（2% glucose, 0.5% yeast extract, 1.5% agar）第二层倒入第一琼脂层上。在3至5天间将抗性菌落置于单独平板上，并通过PCR和amplicon测序用于进一步基因分型。12g00300的互补使用相同程序 without Cas9进行异位整合。

使用Cas9 ribonucleoprotein基因编辑方案生成含潮霉素抗性盒的II5:ΔSIX13突变体如所述 with modifications。具体地，从TR4菌株II5克隆H2B的NLS，并用于替换pET-28b-Cas9-His中的SV40 NLS。使用具有短60 bp同源重叠的潮霉素盒供体模板代替较大同源臂。如上述涂布原生质体。所用引物列于表S1。靶向删除或互补的效应子编码序列和氨基酸序列列于表S3。

4.8 植物生长条件和感染测定

卡文迪什‘Grand Naine’植株在温室中生长，昼/夜温度25°C/23°C，日长16小时，相对湿度80%。

如先前所述进行卡文迪什‘Grand Naine’香蕉植株的感染测定。简言之，将菌株II5、M1和选定突变体接种于PDA平板。使用PDA平板上的琼脂块接种含绿豆肉汤的锥形瓶。锥形瓶在旋转摇床中以150 rpm、25°C培养5天。通过两层无菌cheesecloth过滤培养物收集孢子。随后将孢子悬浮液稀释至1×10⁶孢子/mL。接种前损伤植株根部。最后，每株植株直接倒入200 mL孢子悬浮液于土壤上。在接种后8至10周使用ImageJ量化球茎坏死。

作者贡献

J.D.和A.C.W.收集数据并进行分