CREB乳酰化修饰在FSH诱导卵巢颗粒细胞增殖与分化中的关键作用及机制研究

为解决FSH如何调控卵巢颗粒细胞(GCs)增殖与分化的分子机制问题，研究人员开展CREB乳酰化(lactylation)修饰在FSH信号通路中作用的研究，发现FSH通过诱导CREB K136位点乳酰化促进其磷酸化及转录复合物形成，直接激活增殖与分化基因转录，揭示乳酰化连接代谢与卵泡发育的新机制，为卵泡发育障碍相关不孕症提供治疗靶点。

　　

卵泡发育是女性生殖的核心环节，其核心功能单元卵巢滤泡由单一生殖细胞卵母细胞及外围多层体细胞颗粒细胞（Granulosa Cells, GCs）构成。颗粒细胞作为促性腺激素的主要靶点，其增殖与分化直接决定了卵泡的发育命运。其中，卵泡刺激素（Follicle-Stimulating Hormone, FSH）通过激活经典G蛋白偶联受体（GPCR）/腺苷酸环化酶/cAMP/PKA/CREB信号通路，诱导包括Cyclin D2、Cyp19A1等上百个下游基因的转录，进而驱动颗粒细胞增殖和分化。然而，FSH调控该过程需消耗大量能量，颗粒细胞表现出的强糖酵解活性和乳酸积累现象暗示代谢重编程可能参与其中。近年来，蛋白质乳酰化（lactylation）作为一种新型代谢感知相关的翻译后修饰，在肿瘤发生、肺纤维化等疾病中的作用逐渐被揭示，但其是否以及如何参与FSH调控的卵泡发育尚属未知。

为解决上述问题，南京农业大学动物科技学院的研究团队在《Nucleic Acids Research》发表论文，系统阐释了FSH通过诱导转录因子CREB（cAMP Response Element-Binding Protein）在K136位点的乳酰化修饰，进而促进其功能激活和下游基因转录，最终驱动颗粒细胞增殖与分化的新机制。该研究不仅揭示乳酰化修饰在生殖生物学中的关键作用，还为多囊卵巢综合征（PCOS）等卵泡发育障碍性疾病提供了潜在治疗靶点。

在研究过程中，作者运用了多种关键技术方法：通过乳酰化组学（lactylome）和蛋白质组学（proteomics）联用筛选FSH调控的乳酰化靶点；利用Co-IP、Western blot、免疫荧光等技术验证CREB与乳酰化的相互作用；采用CRISPR/Cas9基因敲除、点突变载体构建及报告基因实验分析K136位点功能；通过ChIP-qPCR和荧光素酶报告实验检测转录活性；结合小鼠体内注射抑制剂（oxamate、C646）及体外细胞模型（人源KGN细胞系及小鼠原代颗粒细胞）进行功能验证；并应用分子对接模拟CREB与PRKACA的互作模式。

研究结果主要包括以下方面：

FSH诱导颗粒细胞增殖伴随乳酸水平升高和乳酰化修饰增强

通过EdU掺入实验、Ki67免疫组化及增殖标志蛋白（PCNA、Cyclin D2）检测，证实FSH显著促进颗粒细胞增殖。同时，FSH处理组卵泡液乳酸水平及颗粒细胞中葡萄糖转运体GLUT1表达上调，全蛋白乳酰化（Pan-Kla）水平在颗粒细胞中特异性升高。

抑制乳酸生成及乳酰化阻断FSH促增殖效应

使用糖酵解抑制剂2-DG、oxamate或乳酸脱氢酶（LDHA/LDHB）双敲低均可降低细胞内乳酸和乳酰酰辅酶A（lactyl-CoA）水平，抑制全局乳酰化及FSH诱导的增殖。补充外源乳酸可逆转上述效应。进一步抑制乳酰辅酶A合成酶ACSS2/SUCLG1同样抑制乳酰化和增殖，表明FSH依赖乳酸-乳酰化轴调控增殖。

FSH促进CREB在K136位点的乳酰化修饰

乳酰化组学分析发现CREB K136位点乳酰化在FSH处理后升高，且该位点在不同物种中保守。Co-IP及免疫荧光证实FSH增强CREB与Pan-Kla的结合，而oxamate处理、LDHA/LDHB双敲或ACSS2/SUCLG1抑制均取消这一现象。构建K136R突变体后，FSH诱导的CREB乳酰化完全消失。

P300是CREB乳酰化的关键催化酶

在多种潜在乳酰转移酶中，仅P300敲低或抑制剂C646处理显著抑制FSH或乳酸诱导的CREB乳酰化。C646处理还抑制颗粒细胞增殖，但不影响全局乙酰化水平，提示P300在GCs中特异性介导乳酰化而非乙酰化。

CREB乳酰化通过招募PRKACA促进其磷酸化

K136与磷酸化位点S133空间相邻。抑制乳酰化（2-DG、oxamate、LDHA/LDHB敲低）或P300活性（C646）均降低FSH诱导的CREB S133磷酸化（p-CREB）。K136R突变体在FSH刺激下p-CREB水平显著低于野生型CREB。体外激酶实验证实乳酰化CREB更易被PKA磷酸化。分子对接显示K136R突变降低CREB与PKA催化亚基PRKACA的结合亲和力，Co-IP实验验证K136R突变削弱PRKACA招募。同时，S133A突变亦减少CREB乳酰化及P300招募，表明乳酰化与磷酸化存在正向互馈调控。

CREB乳酰化独立促进增殖相关基因转录及颗粒细胞增殖

在CREB敲除细胞中回补K136R突变体后，FSH诱导的增殖基因（Cyclin D2、c-FOS）mRNA表达及启动子结合（ChIP-qPCR）显著降低，细胞增殖活性（CCK-8、EdU）减弱。即使回补磷酸化组成型激活突变体S133D，抑制乳酸生成（oxamate）仍削弱增殖效应，而额外补乳酸可逆转。双突变体S133D+K136R较S133D增殖能力下降，表明乳酰化具有不依赖磷酸化的功能。荧光素酶报告实验显示K136R突变或抑制乳酸生成均降低FSH诱导的CREB转录活性，且该效应在S133A突变或PKA抑制剂（H-89）存在时仍部分保留，进一步证实乳酰化直接调控转录活性。机制上，K136R突变抑制CREB与转录共激活因子CBP/P300的结合，即使在高磷酸化状态下（S133D），K136R仍阻碍复合物形成。

CREB乳酰化调控颗粒细胞分化

抑制乳酰化（2-DG、oxamate、LDHA/LDHB敲低、C646）或表达K136R突变体均降低FSH诱导的雌二醇（E2）、孕酮（P4）合成及类固醇生成酶（CYP19A1、CYP11A1、3β-HSD）表达，ChIP-qPCR显示K136R突变削弱CREB与Cyp19A1、Cyp11A1启动子的结合。

体内抑制乳酰化验证FSH调控卵泡发育的机制

小鼠体内注射C646或oxamate可抑制FSH引起的卵巢乳酰化升高、CREB磷酸化及PRKACA/CBP/P300招募，并显著降低颗粒细胞增殖（EdU、Ki67）、分化（激素水平）及卵泡发育（卵泡直径、抗拉卵泡数量）。

该研究结论强调，CREB K136乳酰化是FSH调控颗粒细胞功能的核心分子开关，它通过双重机制发挥作用：一是促进PRKACA招募和S133磷酸化，激活经典CREB/CBP/P300转录复合物；二是直接招募CBP/P300，不依赖磷酸化即可驱动增殖与分化基因转录。这一发现首次将乳酰化修饰与GPCR信号转导、卵泡发育紧密联系，揭示了代谢状态通过翻译后修饰直接调控生殖细胞功能的新范式，为PCOS等卵泡发育障碍相关不孕症提供了新的治疗策略和靶点。