益生菌Enterococcus lactis MNC-168通过膜囊泡激活STING通路增强免疫检查点阻断疗效的机制研究

本研究发现源自健康人群的益生菌Enterococcus lactis MNC-168可通过分泌细菌膜囊泡（MVs）激活STING-IFN-I（干扰素基因刺激因子-I型干扰素）通路，重塑肿瘤微环境，显著增强抗PD-1免疫治疗的疗效。该研究通过多组学分析和临床队列验证，为活体生物治疗剂（LBP）在肿瘤免疫联合治疗中的应用提供了创新性机制支持和转化前景。

　　

引言

近年来，癌症免疫治疗的出现彻底改变了现有的癌症治疗格局，其中PD-L1/PD-1阻断疗法已成为关键基石。然而，当前免疫疗法对多数患者疗效有限，这归因于肿瘤细胞的内在和外在因素，包括对免疫治疗的原发性、适应性和获得性耐药，以及免疫抑制微环境的存在。新出现的证据表明，微生物是先天和适应性免疫的重要调节因子，具有调节化疗药物和癌症治疗免疫治疗剂反应的潜力。

在临床前研究中，已鉴定出几种特定的微生物种类和菌株，通过调节肿瘤微环境提高癌症化疗或免疫治疗的疗效，例如双歧杆菌、乳酸乳球菌和阿克曼氏菌。临床环境中，活体生物治疗药物CBM588与纳武利尤单抗和伊匹木单抗联合使用，显著延长了转移性肾细胞癌患者的无进展生存期，显示了LBP在癌症治疗中的强大潜力。

近年来，肠道微生物群增强免疫治疗的几种分子机制已被阐明。例如，肠球菌肽聚糖重塑通过NOD2信号促进免疫检查点抑制剂（ICIs）免疫治疗。罗伊氏乳杆菌通过产生吲哚-3-醛（I3A）经由AhR途径增强ICIs在抗肿瘤免疫中的功效。病原体相关分子模式（PAMPs）、cGAS-STING通路可被细菌环二核苷酸（CDNs）或细菌膜囊泡（MVs）激活，不仅在病原体防御中，而且在抗肿瘤免疫中发挥关键作用。

尽管关于微生物在癌症治疗中的有益作用已达成共识，但最近的研究报告强调了特定微生物组对癌症的积极影响。因此，复杂肠道微生物组中每个组分在癌症进展和治疗中的具体功能和分子机制仍有待阐明。

在这项研究中，我们比较了黑色素瘤、非小细胞肺癌和肾细胞癌（NSCLC/RCC）患者中对抗PD-1治疗有反应者（R）和无反应者（NR）的微生物组组成，发现肠球菌属在反应者中显著富集。通过体外筛选模型，我们鉴定出从健康个体分离的特定乳酸肠球菌MNC-168（MNC-168）菌株，通过引发全身免疫反应和增强T细胞抗肿瘤免疫，显著抑制MC38生长并增强抗PD-1治疗的疗效。从机制上讲，我们阐明MNC-168释放的MVs可以通过全身循环外渗并优先靶向肿瘤部位，触发STING通路，从而促进抗肿瘤免疫。更重要的是，我们在多个临床前癌症模型中验证了MNC-168对抗PD-1的增强作用，并证明了乳酸肠球菌在临床治疗中增强抗PD-1反应的潜力。这些发现表明，MNC-168有潜力作为活体生物治疗剂来增强癌症治疗。

乳酸肠球菌MNC-168抑制肿瘤生长并增强抗PD-1治疗

为了识别与癌症抗PD-1治疗反应相关的特定微生物特征，我们收集了关于癌症抗PD-1治疗肠道微生物组效应的公开粪便宏基因组测序（MGS）数据，并分析了反应者（R）和无反应者（NR）之间的微生物组成差异。我们发现，在黑色素瘤和NSCLC/RCC研究中，乳杆菌属、乳酸球菌属和肠球菌属在R组中富集，这些菌株已被报道可预防肿瘤发展或促进抗肿瘤免疫。值得注意的是，肠球菌属在癌症中的作用存在争议，这可能是由于特定菌株、实验条件或癌症状况所致。

为了评估肠球菌是否影响抗肿瘤免疫，我们使用人外周血单核细胞（PBMCs）和THP-1体外共培养模型，比较了从健康人粪便中分离的五属肠球菌物种引发的干扰素-γ（IFN-γ）和白介素1β（IL-1β）产生。我们发现，这些菌株中的大多数在两种模型中均显著引发IFN-γ或IL-1β分泌。然而，乳酸肠球菌MNC-168在两种体外模型中均显著增加IFN-γ和IL-1β的产生。因此，我们重点使用细胞因子 beads 阵列（CBA）评估MNC-168在THP-1和PBMC共培养模型中对趋化因子和细胞因子的影响。MNC-168显著提高了THP-1共培养模型中促炎因子（包括IL-6、TNF-α和IL-1β）以及趋化因子（如CCL5、MCP-1和CXCL10）的水平。类似地，MNC-168增加了PBMC共培养上清液中TNF-α、IL-1β、CCL5和MCP-1的水平。此外，在PBMC共培养模型中，MNC-168增加了IFN-γ⁺CD4⁺和IFN-γ⁺CD8⁺ T细胞的百分比，这与IFN-γ分泌的增加一致。肠球菌在对抗免疫治疗有反应的患者中富集，这可能增加了免疫激活。

为了确定MNC-168是否调节癌症免疫治疗的反应，我们建立了用MNC-168或联合抗PD-1治疗的同源肿瘤小鼠模型。将MC38结直肠癌细胞皮下接种到小鼠体内，每天灌胃MNC-168，而当肿瘤体积达到50–100 mm³时，腹腔注射抗PD-1。MNC-168显著减少了MC38肿瘤体积并提高了肿瘤生长抑制率（TGI）。此外，MNC-168和抗PD-1联合给药与单用MNC-168或单用抗PD-1治疗相比， dramatically 增强了抗肿瘤效果。然而，当给予热灭活的MNC-168时，与抗PD-1治疗联合的肿瘤抑制效应被消除。为了进一步确定MNC-168的单独抗肿瘤作用，我们在小鼠MC38肿瘤模型中使用抗生素混合物（ATB）在灌胃MNC-168前2周清除肠道微生物。ATB给药削弱了抗PD-1的治疗效果，而补充MNC-168显著抑制了肿瘤生长，并与抗PD-1联合 dramatically 抑制了肿瘤。为了研究MNC-168与抗肿瘤活性之间的关系，我们给小鼠灌胃了剂量递增的MNC-168或联合抗PD-1。结果表明，当MNC-168以2 × 10⁹ CFU的口服剂量给药时，可观察到抗肿瘤效果，但在2 × 10⁸ CFU时则没有。然而，进一步将剂量增加到2 × 10¹⁰ CFU并未增强抗肿瘤疗效。总之，这些结果表明MNC-168显著抑制肿瘤生长并改善了抗PD-1治疗。

MNC-168引发全身免疫反应并增强T细胞抗肿瘤免疫

接下来，我们探讨了MNC-168在体内抗肿瘤免疫的作用模式。首先，我们使用CBA assay检测了MNC-168处理的MC38小鼠研究血浆中趋化因子和细胞因子的表达。MNC-168在体内显著提高了CXCL1、CXCL9、CXCL10、IFN-γ和TNF-α的水平，这与MNC-168与PBMCs体外共培养时的免疫激活结果一致。这些结果表明MNC-168在全身免疫激活中具有潜在作用。因此，我们进一步评估了MNC-168对外周免疫器官的影响。在MC38模型中，口服MNC-168增加了肠系膜淋巴结（MLN）中CD11c⁺ DCs的数量和CD11c⁺ DCs的MHCII表达，表明MNC-168具有先天免疫激活作用。此外，脾脏中IFN-γ⁺ CD4⁺和IFN-γ⁺ CD8⁺ T细胞的比例在MNC-168治疗后显著增加。此外，与单用抗PD-1相比，MNC-168联合抗PD-1进一步促进了脾脏中IFN-γ⁺ CD4⁺和IFN-γ⁺ CD8⁺ T细胞的比例。在肿瘤微环境（TME）中，MNC-168显著促进了肿瘤内IFN-γ⁺ CD4⁺和IFN-γ⁺ CD8⁺ T细胞的浸润。脾脏和肿瘤组织中FOXP3⁺/CD4⁺细胞的比例在MNC-168治疗后没有变化。

为了确定MNC-168是否通过激活T细胞介导的抗肿瘤免疫来抑制肿瘤生长，我们比较了MNC-168单独或联合抗PD-1在免疫健全和T细胞缺陷小鼠中的作用。与先前报道的治疗效果相似，MNC-168在BALB/c CT26结肠肿瘤模型中显著增强了抗PD-1的抗肿瘤效果，而在裸鼠中这种效果被 dramatically 消除。值得注意的是，在该剂量的MNC-168下，未发现对裸鼠生长有任何 observable 的不良影响，表明MNC-168给药即使在T细胞受损的宿主中也可能不会引起明显的全身毒性。总之，T细胞激活在MNC-168介导宿主抗肿瘤免疫的能力中起着至关重要的作用。

微生物组和代谢组分析MNC-168在同源肿瘤模型中的影响

为了系统研究MNC-168在同源肿瘤模型中的影响，我们首先使用16S rDNA测序分析了用MNC-168和抗PD-1治疗的小鼠的肠道微生物群。我们比较了肠道微生物群的多样性，发现接种肿瘤细胞后，观察到的物种数量和α多样性（香农指数）均显著降低。然而，用抗PD-1或MNC-168单独或联合治疗，使微生物物种丰富度和多样性恢复到类似肿瘤接种前的水平。这一结果与目前的发现一致，即肠道微生物组的更高多样性与多种癌症中对ICIs免疫治疗的改善临床反应相关。PCA还显示，MNC-168治疗组前后肠道微生物群的组成相似，但与对照组不同。此外，线性判别分析效应大小（LEfSe）显示，MNC-168治疗后肠球菌属的丰度显著增加。另外，盲肠内容的代谢组学分析显示，用MNC-168治疗后，几种与调节免疫激活相关的分子增加，包括肌苷和NAD⁺。这些发现表明，MNC-168有潜力恢复肠道微生物群并调节免疫激活，从而有助于抗肿瘤免疫。

MNC-168通过STING通路诱导I型干扰素反应以促进抗肿瘤免疫

为了进一步阐明MNC-168的潜在作用机制，我们对MNC-168联合抗PD-1与单用抗PD-1的肿瘤组织转录组进行了比较分析。共鉴定出474个差异表达基因，其中183个基因显示显著增加，291个基因显示减少。此外，通过基因集富集分析（GSEA），我们确定信号通路不仅在NK细胞增殖中富集，而且还集中在干扰素β反应中。为了验证IFN-β信号在此过程中的作用，我们评估了该小鼠模型中的血清IFN-β水平。与单用抗PD-1治疗相比，MNC-168联合抗PD-1治疗后血清中IFN-β的浓度显著增加。这些发现表明，干扰素反应可能在MNC-168介导的抗肿瘤免疫中发挥调节作用。

I型干扰素（IFNs）激活细胞内抗菌程序并影响先天和适应性免疫反应的发展。抗原呈递细胞（APCs），如巨噬细胞和树突状细胞（DCs），在感知病原体成分和肿瘤抗原时产生I型IFNs，以引发进一步的免疫激活，从而预防感染和肿瘤生长。为了确定MNC-168对先天或适应性免疫的直接影响，我们最初将人PBMCs分化的T细胞与MNC-168培养上清液共培养。然而，我们发现5%或10%的MNC-168上清液均不能诱导CD4和CD8 T细胞活化。因此，我们假设MNC-168可能通过APCs诱导I型IFN产生来促进抗肿瘤免疫。为了验证这一点，我们使用体外THP-1模型来模拟APCs，评估了潜在的调节信号通路。肠球菌已被报道通过NOD2信号通路调节免疫激活。因此，我们首先通过NOD2特异性抑制剂评估了MNC-168是否影响NOD2信号。NFκB报告细胞和特定下游基因检测的结果表明，NOD2信号并未参与MNC-168激活。此外，MYD88是一种先天免疫信号适配器，在诱导I型IFN产生中起着至关重要的作用。使用多西环素（Dox）诱导的MYD88敲低THP-1-IFN-β报告细胞系，我们发现MYD88敲低仅轻微抑制了MNC-168激活的效果。值得注意的是，MNC-168处理不影响细胞活力。这些结果表明MNC-168通过其他机制调节免疫激活。

由于MNC-168诱导IFN-β并非主要依赖MYD88方式，可以设想MNC-168可能通过cGAS/STING依赖性通路触发IFN-β诱导，该通路在抵抗病原体感染和抗肿瘤免疫中发挥重要作用。最近的研究表明，微生物群可以通过STING-I型干扰素依赖性重编程肿瘤微环境并增强ICB疗效。为了测试MNC-168的生物活性及其诱导cGAS/STING通路下游信号的潜力，我们还生成了Dox诱导的STING敲低THP-1-IFN-β报告细胞。MNC-168上清液显著增强IFN-β报告活性，而STING敲低显著降低IFN-β活性。此外，我们使用STING特异性抑制剂H-151评估了MNC-168诱导的IFN-β活性的这一作用。H-151显著减弱了MNC-168上清液处理下的IFN-β报告活性。类似地，STING靶向基因IFN-β和TNF-α的mRNA水平在MNC-168上清液处理下显著上调，而这种上调也被H-151减弱回对照水平。为了验证cGAS/STING信号负责MNC-168处理后的IFN-β诱导，我们检测了TBK1和IRF3的磷酸化水平，它们是STING信号的关键下游效应器。在MNC-168处理后，THP-1细胞中TBK1和IRF3的磷酸化水平增加，而H-151处理阻止了这种信号激活。为了进一步确认MNC-168诱导的IFN-β产生的这一信号转导，我们使用相应的siRNA敲低了THP-1-IFN-β报告细胞中的TBK1或IRF3。然后，我们用MNC-168上清液处理这些细胞，并通过ELISA检测IFN-β报告活性和IFN-β表达。在MNC-168上清液处理下，TBK1敲低或IRF3敲低均显著降低了IFN-β报告活性和细胞的IFN-β蛋白水平。这些发现表明，MNC-168通过cGAS/STING/TBK1/IRF3通路诱导IFN-β产生，从而增强抗肿瘤免疫。

MNC-168通过分泌的MVs触发STING依赖性抗肿瘤免疫

细菌可以通过细菌环二核苷酸（CDNs），如c-di-AMP/GMP，或通过将细菌DNA递送到宿主细胞的细菌膜囊泡（MVs）激活cGAS-STING-IFN-I信号通路。为了确定MNC-168的活性成分，我们使用100 kDa超滤装置从培养上清液中分离了可溶性小分子（含有CDNs、LPS）和大组分（含有大蛋白和MVs）。使用THP-1-IFN-β报告细胞 assay，我们发现过滤后的上清液部分与未过滤的上清液相比，未能激活报告细胞，表明活性成分不是可溶性小分子。我们假设源自MNC-168的MVs可能发挥重要作用。

为了测试这一点，我们进行了DNA测序，以分析用MNC-168处理的小鼠粪便样本中MNC-168 MVs的丰度。我们观察到，与对照组相比，MNC-168治疗后肠球菌来源的MVs丰度大幅增加。此外，与其他肠球菌物种相比，MNC-168 MVs的丰度显著增加，表明MNC-168可能通过分泌的MVs激活STING。

为了进一步研究，我们从MNC-168的培养上清液中分离了MVs并表征了它们的特性。NanoSight技术估计MVs的大小约为200 nm，尽管透射电子显微镜（TEM）显示尺寸范围在50至100 nm，这与之前的报告一致，即NanoSight技术可能高估颗粒大小。琼脂糖凝胶电泳证明，MNC-168衍生的MVs含有大量DNA。与培养上清液类似，MNC-168衍生的MVs诱导了STING依赖性的IFN-β激活，这通过Dox诱导的STING敲低和特定抑制剂处理得到证实。此外，IFN-β和TNF-α的mRNA水平在MVs刺激下增加。为了验证STING信号转导，我们还检测了MNC-168 MVs处理下TBK1和IRF3的磷酸化水平。pTBK1和pIRF3的蛋白水平在MNC-168 MVs处理下增加，而H-151阻止了这种激活。此外，用siRNA敲低TBK1或IRF3，显著阻止了MNC-168 MVs诱导的IFN-β转录活性和产生。这些结果与MNC-168培养上清液的作用一致，表明MNC-168分泌的MVs通过STING信号通路诱导IFN-β产生。

细菌细胞外囊泡能够通过血流到达靶组织或器官，调节特定的生理功能。因此，我们研究了MNC-168释放的MVs是否可以通过血液循环调节抗肿瘤免疫。为了监测它们的体内分布模式，我们采用了一种 established 方法来研究MNC-168 MVs在CT-26肿瘤模型中的运输。将200微克DiR标记的MNC-168 MVs通过灌胃或静脉注射给予CT-26肿瘤小鼠，分别模拟MNC168的给药途径或MV的血源性递送方式。关于灌胃MNC-168 MVs，在给药后0.5小时在胃中检测到荧光，而在给药后3小时减弱，这表明MVs可能被胃液消化。相比之下，通过静脉注射，MVs的荧光可以在体内维持较长时间。注射后半小时，MVs荧光出现在肝脏，并在约3小时达到峰值。在0.5小时检测到微弱的MV信号。随着时间的推移，肿瘤内的MV荧光逐渐增强，并在24小时后达到平台期。终点解剖结果显示，虽然大部分MVs在肝脏积累，但皮下肿瘤和脾脏中也有显著的MVs富集，与肾脏和胃肠道相比。这种现象与目前发现的细菌MVs在肿瘤组织中积累程度更高的现象相似。此外，我们使用降低剂量的MVs注射（从100 μg到25 μg）进一步研究了肿瘤靶向。我们观察到肿瘤中的荧光强度以剂量依赖性方式降低；然而，即使在最低剂量下，仍存在微弱但可检测的MVs信号。这一观察 strongly 支持MNC-168 MVs通过全身循环外渗并优先在肿瘤中积累以触发STING通路，从而有助于抗肿瘤免疫的能力。

作为概念验证，MNC-168在增强抗肿瘤免疫中的作用通过在CT-26肿瘤模型中瘤内注射MNC-168 MVs得到验证。MNC-168 MVs的给药导致肿瘤生长和肿瘤重量的显著抑制。此外，对肿瘤中免疫细胞的分析显示，DCs的数量和IFN-γ⁺CD8 T细胞在响应MNC-168 MVs治疗时显著增加。这些发现表明，MNC-168激活先天免疫并增强T细胞抗肿瘤能力。总之，这些发现表明，MNC-168通过细菌MVs递送DNA激活STING-IFN-I通路，从而增强抗肿瘤免疫反应的疗效。

MNC-168在多种临床前肿瘤模型和临床ICB治疗中增强抗PD-1疗效

尽管免疫检查点阻断（ICB）疗法在患者中取得了良好的效果，但ICB治疗的反应在许多癌症中仍然很低。由于活菌治疗剂主要通过免疫激活发挥抗肿瘤作用，我们采用了具有不同免疫原性和遗传特征以及TME特征的不同同源模型来评估MNC-168在不同肿瘤类型中的活性广度。在肾细胞癌模型中，一个经过验证具有高度免疫浸润的模型，给予MNC-168显著抑制了Renca肿瘤生长，并进一步提高了抗PD-1治疗的疗效。在纤维肉瘤模型中，抗PD-1治疗在大多数小鼠中显示 minimal 反应，口服MNC-168显著减少了肿瘤体积，并 dramatically 增强了对抗PD-1治疗的反应。类似地，在H22小鼠肝癌模型中，其特征是免疫抑制性肿瘤微环境，单用MNC-168或抗PD-1治疗对H22肿瘤生长的影响有限；然而，它们的联合导致肿瘤生长的显著抑制。值得注意的是，MNC-168在多种同源模型（免疫原性和TME特征不同）中表现出疗效，表明其具有广泛但 context-dependent 的活性。此外，共同给予MNC-168和抗PD-1导致H22肿瘤微环境中CD4⁺和CD8⁺ T细胞以及IFN-γ⁺阳性细胞的浸润增加，这与在MC38模型中观察到的免疫激活一致。为了进一步评估潜在的转化能力，采用了人源化肺癌模型来评估MNC-168在人类免疫环境中是否保持疗效。虽然人源化系统存在固有局限性（例如，不完全的免疫重建和缺乏人类微生物群），我们的数据表明MNC-168 prevented 肿瘤生长并增强了抗PD-1治疗效果。这些发现表明，MNC-168在增强多种癌症类型抗PD-1治疗疗效方面具有潜在作用。

为了进一步评估MNC-168的临床潜力，我们分析了一项I期临床试验的宏基因组和肿瘤RNA-seq数据，该试验涉及对抗PD-1难治性转移性黑色素瘤患者进行来自完全反应者的粪便微生物移植（FMT），随后重新诱导抗PD-1治疗。尽管这项临床研究规模有限，但其疗效和免疫调节结果 highly 有前景。因此，我们比较了反应者（R）组和无反应者（NR）组中乳酸肠球菌（对应于MMC-168的物种）的丰度，发现R组中乳酸肠球菌的丰度显著增加。此外，我们通过比较R组和NR组之间肿瘤的转录组谱，并分析与乳酸肠球菌丰度的关系，深入研究了我们在临床前研究中确定的机制。我们的发现揭示，与I型干扰素（IFN） signature 相关的大多数基因在R组中上调，并与乳酸肠球菌丰度呈正相关。类似地，与树突状细胞（DC）和CD8⁺ T细胞活性相关的基因在R组中表现出更高的表达水平，这与乳酸肠球菌的丰度呈正相关。

此外，LBPs的安全性代表了决定其作为免疫治疗佐剂潜在用途的关键挑战。因此，我们在Sprague Dawley（SD）大鼠上进行了MNC-168的毒性研究，分别以低、中、高剂量的MNC-168发酵粉灌胃，观察在28天给药期间和28天恢复期后可能的 adverse effects。所有动物在预定的尸检日存活，并且在本研究中没有计划外的死亡或垂死动物。与阴性对照组（0 CFU）相比，在给药和恢复期间，所有测试组的雄性和雌性动物的体重或食物消耗没有显著差异。临床病理学分析的摘要数据见补充文件7。因此，MNC-168的给药没有对宿主产生任何 observable adverse effects，表明其对于 future IND-enabling 研究具有潜在安全性。

这些数据证明了乳酸肠球菌增强临床抗PD-1治疗疗效的潜力，强化了我们的临床前观察，即MNC-168通过STING信号激活抗肿瘤免疫，以增强抗PD-1治疗的有效性。

讨论

尽管近年来癌症治疗取得了显著进展，但仍有相当比例的患者对当前治疗选项反应不佳。因此，治疗那些对当前疗法耐药癌症患者仍然是一个紧迫且未满足的临床需求。新出现的证据强调了肠道微生物群在调节癌症治疗反应中的关键作用，包括免疫检查点抑制剂（ICIs）。在这项研究中，我们发现肠球菌属在对抗ICIs有良好反应的患者中丰富。具体来说，我们鉴定出MNC-168，一种乳酸肠球菌菌株，作为有前途的候选者，通过引发强大的全身免疫反应和增强T细胞介导的抗肿瘤免疫来增强抗PD-1治疗的疗效。从机制上讲，我们阐明了一种 novel 直接通路，即MNC-168通过分泌细菌膜囊泡（MVs）激活STING-IFN-I通路，以靶向肿瘤并增强抗肿瘤免疫，这与之前关于细菌CDNs在STING激活中的报道、鸡肠球菌MRx0518的鞭毛蛋白在TLR5激活中的作用以及肠球菌SagA在NOD2激活中的作用有所区别。此外，我们在多个临床前癌症模型中验证了MNC-168对抗PD-1治疗的增强作用，加强了其转化潜力。重要的是，我们对已发表临床数据的分析也表明，乳酸肠球菌可能增强患者对抗PD-1治疗的反应，进一步强调了我們发现的临床相关性。总之，这些结果将MNC-168定位为一种 novel 活体生物治疗产品，具有提高癌症免疫治疗疗效的潜力。通过利用肠道微生物群的免疫调节特性，MNC-168为开发更有效和个性化的癌症治疗提供了有前途的途径。