靶向ROS-NEK7-NLRP3轴：MCC950浓度梯度优化改善2型糖尿病视网膜病变的新机制

本研究针对2型糖尿病视网膜病变(DR)中NLRP3炎症小体异常激活的难题，通过玻璃体腔注射浓度梯度MCC950(0.01-10 mM)干预，发现1 mM MCC950通过抑制ROS-NEK7-NLRP3信号轴，显著改善视网膜病理损伤、氧化应激和细胞凋亡，为DR的精准抗炎治疗提供了新策略。

　　

在全球范围内，2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)占所有糖尿病病例的90%以上，而糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy, DR)是其最主要的微血管并发症，导致全球约34.6%的糖尿病患者视力丧失，在晚期阶段可能造成不可逆的视力损失或失明。目前DR的治疗手段十分有限且效果不佳，传统治疗方法如降糖药物、视网膜激光光凝和抗血管内皮生长因子(anti-VEGF)治疗要么效果有限，要么伴随显著副作用，而玻璃体切除术仅适用于严重玻璃体出血或牵引性视网膜脱离等终末期并发症。这些手段无法逆转早期微血管炎症损伤，也缺乏对NLRP3驱动的固有免疫激活的直接干预，凸显了靶向上游炎症通路的紧迫性。

NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)是触发糖尿病并发视网膜血管炎症的关键因子之一。在高糖和氧化应激等危险信号刺激下，NLRP3通过招募凋亡相关斑点样蛋白(ASC)和半胱天冬酶-1(caspase-1)形成复合物，促进炎症因子白细胞介素1β(IL-1β)和白细胞介素18(IL-18)的成熟和释放，引发炎症级联反应。值得注意的是，NIMA相关激酶7(NEK7)在NLRP3炎症小体激活中扮演重要角色——它作为丝氨酸/苏氨酸激酶，是炎症小体激活和细胞分裂之间的开关，NEK7与NLRP3的相互作用依赖于NLRP3结构域中的富亮氨酸重复序列(LRR)或NOD结构域与NEK7的激酶结构域。因此，NEK7-NLRP3结合是NLRP3炎症小体组装和激活所必需的。在DR中，NEK7与活性氧(ROS)相互作用的机制尚未探索，这为研究新的治疗靶点提供了重要方向。

MCC950作为NLRP3的高特异性抑制剂，不仅能抑制ASC复合物的形成，还能通过高亲和力结合NLRP3的NACHT结构域中的ATP酶活性中心，阻断炎症小体寡聚化和caspase-1激活，从而抑制IL-1β/IL-18的成熟。在DR中，玻璃体腔注射MCC950可以穿透内界膜直接作用于视网膜，显著降低米勒细胞炎症因子分泌并修复血-视网膜屏障。然而，现有研究大多使用固定剂量（通常为10 mg/kg），缺乏针对视网膜局部给药的有效浓度研究，且MCC950调节NEK7-NLRP3通路及其与ROS通路相互作用的机制尚不明确。

为了回答这些问题，任科学和李晓峰研究团队在《Scientific Reports》上发表了最新研究成果，系统探讨了不同浓度MCC950对2型糖尿病大鼠视网膜结构和功能的影响，并揭示了其作用机制。

研究人员采用高脂饮食联合腹腔注射链脲佐菌素(STZ)诱导雄性SD大鼠T2DM模型，通过玻璃体腔注射不同浓度MCC950(0.01、0.1、1、10 mM)进行干预。主要技术方法包括：HE染色评估视网膜病理结构变化；TUNEL染色检测细胞凋亡；免疫荧光分析NEK7表达和ROS水平；Western blot检测NLRP3炎症小体通路相关蛋白表达。

Changes in body weight and blood glucose in rats

研究期间，大鼠的体重和血糖水平每两周被仔细监测。结果显示，NC组大鼠体重稳定增加，血糖水平保持在3.6-4.3 mmol/L范围内。而糖尿病大鼠在摄入高糖高脂饮食后，体重和血糖水平均比常规饲料喂养的NC组增加更快，从第8周开始出现统计学显著差异。STZ腹腔注射诱导糖尿病后，大鼠表现出血糖升高、多饮多食和体重减轻等症状，毛发脏黄且易怒，这些症状与糖尿病一致，表明T2DM模型成功构建。MCC950治疗组的血糖和体重水平未显示统计学显著变化，这可能与MCC950治疗周期较短、药物代谢和排泄导致全身循环浓度较低以及玻璃体内局部作用而非全身血液循环效应有关。

Effects of different concentrations of MCC950 on histopathological damage of rat retina

随着T2DM的进展，大鼠视网膜出现病理损伤。HE染色显示，NC组视网膜厚度显著高于其他组。STZ诱导的糖尿病大鼠视网膜出现病理损伤：视网膜层结构紊乱、视网膜前新生血管形成（红圈标注）和小动脉血栓形成，以及视网膜 ganglion 细胞减少。然而，各组间GCL厚度无显著差异。IPL、INL和ONL比NC组薄，MCC950治疗组改善了其厚度。OPL比NC组薄，组间无显著差异。与T2DM组相比，1 mM浓度MCC950治疗显著改善了IPL、INL和ONL的结构，IPL和ONL细胞排列趋于整齐，血管基底膜增厚和渗出性病变显著减少。

Effects of different concentrations of MCC950 on apoptosis in rat retinal tissues

为评估不同浓度MCC950对视网膜组织细胞凋亡的影响，研究人员通过TUNEL法检测了大鼠视网膜组织细胞凋亡。结果显示，STZ诱导的糖尿病大鼠视网膜凋亡显著增加，不同浓度MCC950(0.01、0.1、1、10 mM)对长期高血糖诱导的视网膜组织凋亡有不同程度的影响，浓度反应在1 mM达到峰值——视网膜凋亡显著改善，差异具有统计学意义。Western blot显示，T2DM大鼠视网膜中Bax表达显著升高，Bcl-2显著降低，差异具有统计学意义。Bax/Bcl-2比值的增加通过激活caspase-3级联反应驱动视网膜 ganglion 细胞和血管内皮细胞凋亡，从而加剧血-视网膜屏障的破坏。MCC950治疗后，抗凋亡蛋白Bcl-2表达上调，促凋亡Bax蛋白表达下调，导致Bcl-2/Bax比值增加，进一步证实了其抗凋亡作用。

Effects of different concentrations of MCC950 on ROS expression in rat retinal tissues and correlation analysis with NEK7 expression

为验证MCC950是否能通过特异性结合NLRP3阻断糖尿病视网膜病变中的NEK7/NLRP3通路从而达到治疗效果，研究人员使用免疫荧光定位分析了视网膜中NEK7表达水平。结果显示，在NC组，NEK7免疫荧光信号（绿色）主要定位于视网膜的 ganglion 细胞层(GCL)和内核层(INL)，表达较弱，即生理状态下NEK7的基础表达水平较低。在T2DM组，NEK7的荧光信号显著增强，广泛分布于 ganglion 细胞层、内核层和血管周围区域。定量分析显示，T2DM组的荧光强度显著高于NC组，表明糖尿病病理诱导了NEK7表达的上调。在MCC950浓度梯度治疗组中，NEK7表达水平不同程度降低，其中1 mM浓度抑制NEK7表达最显著，表明MCC950可能逆转了T2DM诱导的NEK7异常激活。

此外，为验证浓度梯度MCC950对T2DM组糖尿病大鼠视网膜凋亡和氧化损伤的保护作用，研究人员检测了各组大鼠视网膜组织中ROS的表达，并进一步分析了ROS与NEK7表达的相关性。结果表明，与T2DM组糖尿病大鼠相比，10 mM浓度组治疗下ROS积累减少，但无统计学显著差异；在0.01 mM至1 mM浓度范围内，ROS表达随着MCC950浓度的增加逐渐降低，在1 mM浓度时表达最低。Pearson相关分析显示，大鼠视网膜组织中NEK7荧光强度与视网膜ROS水平呈显著正相关，表明NEK7在调节视网膜氧化应激中起重要作用，验证了ROS通过上调NEK7激活NLRP3炎症小体。

Gradient MCC950 inhibits NEK7/NLRP3 pathway-related protein expression

为阐明不同浓度MCC950对大鼠视网膜NEK7/NLRP3通路的影响，研究人员通过Western blot检测了NLRP3、NEK7和ASC蛋白的表达。ASC（点状蛋白）在NLRP3炎症小体激活中起中心桥梁作用：其PYD结构域与NLRP3结合，CARD结构域募集caspase-1，驱动炎症小体组装。实验结果显示，与NC组相比，T2DM组大鼠视网膜组织中NLRP3、NEK7和ASC蛋白表达显著升高。MCC950干预抑制了上述蛋白的表达，其中1 mM浓度组的抑制效果最显著。

定量分析显示，糖尿病视网膜中NEK7与NLRP3蛋白表达呈强正相关(Pearson's r=0.62, R²=0.38)。尽管样本量有限限制了统计学显著性，但大的效应量符合它们已确立的功能相互作用，进一步证实了NEK7-NLRP3复合物在DR病理过程中的协同作用。

Effect of different concentrations of MCC950 on the expression of inflammatory factors in rat retina

为验证不同浓度对各炎症因子在大鼠视网膜中表达的影响，研究人员通过Western blot检测了所有大鼠视网膜组织中炎症因子Caspase-1、Cleaved-Caspase-1、IL-1β和IL-18的表达。结果表明，与NC组相比，T2DM组糖尿病大鼠炎症因子表达显著升高，差异均具有统计学意义。当不同浓度MCC950注射到T2DM大鼠玻璃体腔时，炎症因子Caspase-1、Cleaved-Caspase-1、IL-1β和IL-18的释放不同程度减少，并在1 mM浓度时达到最低。

研究

研究结论与讨论部分指出，DR以慢性炎症驱动的进行性视网膜血管损伤为特征，导致血-视网膜屏障破坏、病理性新生血管形成和神经变性，最终导致不可逆的视力丧失。高糖诱导的ROS-NEK7-NLRP3信号轴是驱动DR早期血管损伤的核心机制：氧化应激驱动NEK7-NLRP3复合物的形成，进而组装和激活炎症小体损伤视网膜。高血糖通过多元醇途径激活和晚期糖基化终末产物(AGEs)积累触发视网膜ROS爆发，进而磷酸化NEK7激酶的Tyr97位点，促进NEK7与NLRP3的LRR结构域结合，形成稳定的NEK7-NLRP3复合物。该复合物作为损伤相关分子模式(DAMP)的核心传感器，招募ASC连接蛋白并激活caspase-1，其NACHT结构域作为NLRP3的ATP酶活性中心，通过水解ATP驱动寡聚化，其WalkerA/B基序的构象变化是炎症小体组装的限速步骤。激活的caspase-1通过促进血管内皮焦亡和释放成熟IL-1β/IL-18双途径介导视网膜损伤。总之，高糖诱导的ROS-NEK7-NLRP3轴协调了驱动DR视网膜损伤的分子事件级联，为理解DR的发病机制提供了新视角，并为开发靶向治疗策略指明了方向。

核心疗法各有局限性，如抗VEGF反应率有限和激光对视野的损伤。临床对神经保护性和炎症靶向性治疗的需求未得到满足。新兴疗法包括NLRP3抑制剂、基因治疗、神经保护剂和口服多靶点药物，但只有MCC950能缓解DR的早期炎症。多项研究验证了MCC950的治疗潜力，在高糖条件下，它不仅能抑制米勒细胞和人类视网膜内皮细胞(HRECs)的凋亡，同时保持血-视网膜屏障的完整性，还能阻断NEK7-NLRP3相互作用并下调炎症因子水平。玻璃体腔注射MCC950显著减少血管渗漏并逆转高糖诱导的视网膜组织学损伤。本研究进一步证实了MCC950在抑制视网膜凋亡、炎症反应和修复视网膜结构方面的有效性，为其在DR治疗中的应用提供了更充分的实验基础。

本研究首次优化了MCC950的玻璃体注射浓度，发现1 mM为最佳浓度，在此剂量下，MCC950实现了有效的玻璃体内治疗，同时保持较小的全身暴露，大大减少了潜在的副作用。MCC950通过同时缓解早期DR炎症、凋亡和氧化损伤提供更全面的保护。值得注意的是，在10 mM浓度下观察到的疗效降低可能归因于过高浓度下的负反馈激活、非特异性效应或代谢因素。

然而，研究存在一些局限性需要在未来解决：通过co-ip直接验证NEK7-NLRP3结合，开发改进的递送系统（如缓释制剂）以延长疗效，以及需要验证MCC950对血-视网膜屏障的长期影响。

总之，本研究证实靶向NACHT结构域的MCC950(1 mM玻璃体注射)通过阻断ROS-NEK7-NLRP3轴，为DR提供了机制驱动的治疗策略。