综述：探索紧密连接蛋白：从序列基序到其对紧密连接介导信号通路的影响

本综述系统解析了紧密连接核心组分——claudin（CLDN）蛋白家族的多功能特性。文章从序列与结构视角出发，深入探讨了CLDN蛋白在进化中形成的高度保守基序（如第一胞外环ECL1和C端PDZ结合域）如何调控屏障功能、离子选择性和蛋白互作，并详细阐述了其通过调控关键信号通路（如PI3K/AKT、Wnt/β-catenin）参与细胞增殖、存活及通透性调节的分子机制，为基于CLDN的疾病诊断标志物开发和靶向治疗策略提供了重要理论依据。

　　

引言

Claudin（CLDN）蛋白家族是一类四跨膜蛋白，主要表达于上皮和内皮细胞的紧密连接（Tight Junctions）中，通过形成选择性屏障调控离子、分子和细胞的旁细胞转运。哺乳动物CLDN家族包含27个成员（啮齿类特有CLDN13，人类有26个亚型），其分子量介于21-34 kDa之间。CLDN蛋白的典型结构包括四个跨膜结构域（TMD1-TMD4）、短胞质N末端、延伸的C末端胞质域、两个胞外环（ECL1和ECL2）以及一个胞内环。其功能多样性源于高度保守的结构基序，尤其是胞外环和C末端PDZ结合基序，这些区域不仅介导CLDN蛋白与其他紧密连接组分的相互作用，还精确调控旁细胞转运过程。CLDN功能紊乱与多种疾病密切相关，包括癌症、炎症性疾病和代谢综合征。

CLDN蛋白的系统发育关系与基序组成

通过多物种（人、小鼠、牛、羊、猪、马、犬）系统发育分析发现，CLDN1-10、14、17和19等成员呈现高度序列同源性。CLDN1与CLDN7、CLDN2与CLDN14分别形成独立进化分支，提示这些蛋白在进化过程中可能经历了类似的选择压力。CLDN家族可进一步划分为“经典”和“非经典”亚类，但其具体成员划分仍存争议。序列基序分析揭示，CLDN蛋白包含两个关键功能区域：无序区域（可能参与动态构象变化与功能调控）和与TJP1、TJP2、TJP3相互作用的C末端区域（主要介导细胞间连接与屏障功能）。值得注意的是，这些功能区域均位于蛋白末端，且TJP结合区域在经典CLDN蛋白中呈簇集分布，与C末端保守YV基序密切相关。

保守位点的发现及其功能分析

通过InterPro分析技术，在CLDN蛋白第48-64位氨基酸区域鉴定出一个功能关键的保守位点。该位点位于CLDN蛋白的第一胞外环（ECL1），由四个β折叠（β1-β4）和一个胞外螺旋构成，形成反平行β片层结构，在CLDN家族中高度保守，是细胞间连接形成的结构基础。保守位点主要由β3和β4结构组成，可能直接介导蛋白-蛋白相互作用或配体结合。

ECL1具有特征性序列（Gly-Leu-Trp-x-x-Cys-(8-10aa)-Cys），其中的半胱氨酸可能形成分子内二硫键以稳定蛋白构象。更重要的是，ECL1中酸性/碱性氨基酸的分布模式直接决定了离子通道选择性和通透性。分子动力学模拟显示，这些带电残基形成动态静电网络，实现离子选择性过滤和pH敏感的门控调控。例如，CLDN4中ECL1的赖氨酸65残基对控制旁细胞通透性至关重要；而在CLDN15中将酸性残基替换为碱性残基可使旁细胞途径的电荷选择性从阳离子偏好转变为阴离子偏好。这种离子选择性与多种疾病发病机制密切相关，如claudin-16或claudin-19突变导致家族性低镁血症，claudin-2高表达与肠道Na⁺和水通透性增加密切相关。

与ZO蛋白家族的相互作用及其与磷酸化的关系

CLDN蛋白通过C末端修饰进行动态调控。针对丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基的激酶通过磷酸化该结构域来控制CLDN的定位和功能状态。除磷酸化外，C末端还包含SUMO化、棕榈酰化和泛素化修饰位点，共同参与CLDN在细胞环境中的时空调控。研究表明，蛋白激酶A介导的CLDN3 Thr-192磷酸化会损害其寡聚化，导致卵巢癌细胞中紧密连接稳定性破坏。此外，该区域包含典型PDZ结合基序（如-K/R/H-X-Y-V），使其能够与含PDZ结构域的支架蛋白（如ZO-1）特异性相互作用，促进claudin蛋白整合到细胞内信号网络中，并有助于细胞极性和细胞间连接稳定性的调控。

为了深入理解ZO蛋白与CLDN蛋白相互作用的分子机制，研究人员解析了CLDN1和CLDN2与ZO-1 PDZ结构域的复合物结构。结构分析表明，CLDN1和CLDN2的C末端胞质域与ZO-1的PDZ结构域具有一定的结合亲和力。特别是CLDN1和CLDN2的C末端YV（Tyr-Val）序列与ZO-1的PDZ结构域形成关键的氢键网络，这是复合物稳定性的重要相互作用。具体而言，CLDN1与ZO-1的相互作用涉及Gly-207、Tyr-210和Ser-205等残基与ZO-1的Ser-115、Tyr-119和Lys-110之间的疏水相互作用；而CLDN2与ZO-2的相互作用则涉及ZO-2的Tyr-114、Glu-20、Thr-23和Ser-98与CLDN2的Phe-221、Lys-218和Ser-208之间的疏水结合。

CLDN蛋白的磷酸化状态在其与ZO蛋白相互作用中起关键调控作用，这一机制在多种疾病的发生发展中具有重要意义。实验结果表明：在炎症性肠病（IBD）中，CLDN-2的磷酸化状态显著影响其与ZO-1的结合能力，从而调节肠上皮屏障的通透性和功能；在糖尿病肾病中，CLDN-1的磷酸化状态通过调节其与ZO-1的相互作用直接影响肾小球滤过屏障的完整性。基于MAGUK家族蛋白（特别是MAGI2的GK结构域）能够以磷酸化依赖性方式结合磷酸化肽段的发现，研究人员推测CLDN蛋白C末端的多个磷酸化位点可能在其与ZO蛋白的结合中起关键作用。

CLDN在生理与病理中的信号网络

紧密连接的完整性和功能很大程度上取决于紧密连接蛋白的表达和功能。如图所示，CLDN蛋白通过多种信号通路与其他蛋白相互作用，影响细胞的多种生理功能。

这些信号通路包括细胞极性与增殖、细胞分化、细胞存活和细胞间通透性。例如，CLDN蛋白与ZO-1、ZO-2和ZO-3相互作用影响细胞骨架重组，进而影响细胞极性和增殖；它们与E-cadherin和β-catenin相互作用调节细胞分化；与Bcl-2家族成员（如Bcl-2、Bcl-xL）的相互作用可能调节线粒体凋亡途径；而与Occludin和JAM的协同作用调节紧密连接链的组装以调控通透性。这些相互作用的失调可能导致多种疾病的发生，如癌症、炎症性肠病和神经退行性疾病。

CLDN蛋白表达异常或功能障碍可能导致细胞增殖失调、紧密连接结构和功能受损以及细胞存活异常——这些病理改变与多种疾病的发生发展密切相关。例如，CLDN蛋白与Rac1和RhoA等小GTP酶相互作用影响细胞骨架重组，从而调节细胞增殖。具体而言，Rac1和RhoA激活下游信号分子如PAKs和ROCK，这些分子调节细胞骨架动力学，从而控制细胞形态和运动。这种调节机制的破坏可能导致细胞增殖失控，增加癌症风险。此外，CLDN蛋白与Occludin和JAM相互作用维持紧密连接的结构和功能，这对细胞间通透性至关重要。这些相互作用的失调可能损害紧密连接的完整性，导致炎症性肠病的发生。此外，CLDN蛋白与Bcl-2和Bcl-xL相互作用调节细胞存活。其潜在机制涉及Bcl-2和Bcl-xL抑制凋亡途径，如Caspase 3的激活，从而促进细胞存活。CLDN-Bcl-2/Bcl-xL相互作用的失调可能损害凋亡控制，这一过程在神经退行模型中被证实与病理发生相关。

claudin顺式堆叠与反式配对构建紧密连接屏障

Claudins作为紧密连接的主要密封蛋白，通过同型和异型相互作用聚合形成这些细胞间复合物的结构支架。CLDNs的胞外环（ECL1和ECL2）包含β片层和α螺旋结构，通过疏水相互作用和氢键形成稳定的多聚体。Furuse等人的开创性工作表明，claudins alone具有组装成功能性紧密连接链的内在能力，这在表达claudin-1/-2的成纤维细胞中形成的特征性冷冻断裂链中得到证实。在同一细胞膜内，CLDN蛋白通过其跨膜结构域和胞外环进行顺式相互作用形成寡聚体，FRET研究证实了CLDN1、CLDN2、CLDN3和CLDN5之间存在异源复合物。不同CLDNs的异型结合具有选择性；例如，CLDN3可以与CLDN1、CLDN2和CLDN5形成反式细胞关联，而CLDN1与CLDN5之间的结合相对较弱。此外，特定配对如CLDN16和CLDN19需要异源聚合才能正确靶向紧密连接。这些膜内相互作用具有功能意义，因为它们的破坏可能引发occludin依赖性凋亡。在相邻细胞之间，claudins通过其胞外结构域进行反式相互作用，以同型配对（如claudin-1/-1）为主，但选择性异型组合（如claudin-1/-3或肾脏claudin-16/-19）有助于组织特异性功能，如镁重吸收——其突变导致家族性低镁血症（FHHNC）。组装过程始于内质网质量控