人用疫苗佐剂研究的新趋向

《生命的化学》2000年20卷5期

　

人用疫苗佐剂研究的新趋向

管孝鞠， 吴玉章
(第三军医大学免疫学研究所，重庆 400038)

关键词：人用疫苗；佐剂；细胞免疫
中图分类号：R979.5        文献标识码：A

        随着免疫机制的进一步阐明及生物学技术的进步，疫苗的研究已逐渐从以往盲目筛选及混合物形式，向靶向和表位抗原分子设计及人工全成方向发展，疫苗作用的特异性与安全性均有提高。但由于绝大多数新型疫苗的免疫原性较差，因此对佐剂的研究提出了新的挑战，要求从过去单一追求诱导抗体的传统佐剂研究逐渐转向致力于细胞免疫的新型佐剂研究。新型佐剂的研究不仅对于预防性疫苗的应用具有重要意义，而且将有力地推动新一代粘膜疫苗、治疗性疫苗和联合疫苗的研制。
       人用疫苗佐剂的安全与有效性是不可或缺的两个方面，目前最常见的人用疫苗佐剂虽然仍是氢氧化铝和磷酸铝，但近年来，着眼于这两个方面的问题，人用疫苗佐剂的设计、研制和开发研究也取得了许多进展。
1.APC佐剂
        一些佐剂通过刺激抗原递呈细胞(APC)，影响抗原识别、加工与处理过程，由于APC分泌的IL-12和IFN-_γ等细胞因子具有影响辅助性T(Th)细胞分化和细胞毒T细胞(CTL)效应的作用，所以APC佐剂在肿瘤和过敏等疾病的治疗中可能得到有效应用。
        树(状)突细胞(dendritic cell, DC)是重要的APC，被认为是诱导肿瘤免疫颇有希望的佐剂。提高免疫系统介导肿瘤退化的能力已成为肿瘤免疫学中的热点课题，最近肿瘤特异性抗原的鉴别及对T细胞免疫应答和肿瘤逃避机制的进一步认识推动了这一课题的研究，DC可能在这些机制中起关键作用^[1]。体外从血液前体中产生这些细胞的可能性开创了肿瘤免疫治疗的新纪元。许多佐剂的作用可能与激活APC有关，如咪唑喹啉类化合物^[2]、细胞因子类(如IL-12)及CpG等^[3]。淋巴细胞活化基因(lymphocyte activation gene-3, LAG-3)的产物是一种与CD4相关的MHC II类配基，可作为疫苗佐剂，能够通过MHC II类分子刺激APC^[4]。
2.T细胞佐剂
        T细胞佐剂是一个相对较新的概念，此概念最早是由Talmadge等提出的(1985)，指有目的地使用具有抗原或T细胞表位的佐剂物质，该类物质所具有的优先诱导或仅诱导T细胞应答的特性，可通过测定CTL或迟发型超敏反应(DTH)的产生来判定。而T细胞佐剂是指那些能够优先刺激DTH的物质，由于T细胞免疫可有效控制和杀伤细胞内病原体和肿瘤细胞，也是当前抗感染和抗肿瘤领域中的一个中心课题。目前在美国唯一注册的人用佐剂为铝佐剂，它至多是一弱DTH诱导剂。弗氏完全佐剂(FCA)是较好的DTH诱导剂，但由于毒副作用的存在，不宜用于临床，主要用于实验室研究，为此所作的许多工作致力于阐明分支杆菌细胞壁和其它细菌万分的佐剂特性，包括两类主要的活性分子：一是胞壁酰二肽(MDP)及其相关类似物，二是脂多糖内毒素(LPS)及脂质A类似物。MDP可与各种赋形剂(载体)如铝化合物或与角鲨烯阻断共聚体或纯化矿物油一起用于乳剂，可提高DTH(Allison & Byars, 1991)，但这些佐剂中无一分子可选择性引起DTH。天然感染(如牛痘)可产生选择性DTH；低剂量环磷酰胺与分支杆菌合用是最早的实验性T细胞佐剂。此类佐剂主要通过影响Th细胞的分化及功能，从而影响CTL应答，可望在癌症和爱滋病等的治疗中得到越来越多的应用，这也是近年来人用疫苗佐剂研究的新趋向之一。
2.1  Th1极化佐剂的研究
        淋巴细胞的Th0细胞主要分化为两个亚群：Th1和Th2。使Th细胞更多沿Th0→Th1分化，称为Th1极化。近年来，Th1极化佐剂的研究为新的研究热点。一些佐剂配方包括微生物来源的FCA、SAF-1、MDP、MPL，细胞因子如IL-12、γ-菊粉、硬脂酰酪氨酸、脂质体、QS21等均可刺激小鼠产生Th1型应答，此类佐剂可望成为感染、肿瘤、过敏及某些自身免疫性疾病的免疫治病中的新型疫苗佐剂或免疫调节剂[6]。
2.2  胸腺肽和胸腺素样药物
        除了上述Th1极化佐剂外，胸腺肽混合物形式如胸腺素V(thymosin fraction V)或thymostimulin(TP1)，单个肽如胸腺生成素(thymopoietin)、胸腺素(thymosin)和胸腺体液因子(thymichumoral factor)等具有胸腺素样作用，即促进T淋巴细胞分化、增殖、细胞因子生成、细胞毒性和DTH等作用，也是一类重要的T细胞佐剂。
       另两类具有胸腺素样作用的药物，一类是以左旋咪唑(levamisole)为首的含硫化合物，包括二乙基二硫氨基甲酸酯(diethyldithiocarbamate)，可能仅在体内具有胸腺素样作用，其作用可能通过诱导血清胸腺素样因子介导的(Renoux & Renoux,1977)；另一类以isoprinosine为首，包括一个新成员甲基肌苷单磷酸盐(methyl inosine monophosphate,MIMP)，这是一种体外和体内均能刺激T淋巴细胞分化和功能，体内可刺激DTH的嘌呤(Hadden等，1992)，与胸腺激素制剂相比，它们对T细胞具有相对特异的作用，作为佐剂使用均可提高DTH(Exon等，1986)。
        基于它们的免疫药理学特性，推测胸腺肽和胸腺素样药物可能作用于Th1细胞，但尚未得到直接证明。研究表明，MIMP可提高对单核细胞增多性李斯特菌的抵抗力，此抵抗力取决于Th1细胞介导的免疫应答(Semenenko等，1993)。MDP等物质在李斯特模型中无活性，表明MIMP的胸腺素样免疫药理作用与MDP及其类似物集中于B细胞免疫药理作用不同，而可能与其T细胞佐剂性有关。
2.3  其它药物、化学物
       大环内酯抗生素除了抗微生物特性外，还具有独特的免疫刺激作用。红霉素(erythromycin,EM)是一种14元大环内脂，其免疫刺激作用包括可提高质粒DNA免疫小鼠的抗原特异性IgG2a抗体生成，抗原特异性CD4⁺ T细胞产生的IFN-γ和CTL应答^[7]。另一大环内酯抗生素甲红霉素(clarithromycin,CAM)可提高接受化疗和/或放疗癌症患者的存活率，诱导自然杀伤细胞活性和提高CD8⁺T细胞的细胞毒性，具有诱导辅助性T细胞亚群平衡分化的作用^[8]。研究显示，新型抗风湿病药物TAK-603可选择性抑制Th1细胞因子的生成，这与其对动物模型细胞免疫的作用相一致(Ohta,1997)。
2.4  植物来源佐剂
       原黄连素生物碱的黄连素(小檗碱，berberine)是从刺檗(Berberis vulgaris)的根和树皮中分离得到的主要生物碱之一，可在体外显著仰制小鼠脾细胞对T细胞依赖性促细胞分裂剂(有丝分裂原，mitogen)、伴刀豆球蛋白A(Con A)和植物凝集素(PHA)的增殖应答^[9]。带刺荨麻叶提取物在德国已注册作为风湿病的佐剂治疗。在一全血培养系统中，荨麻提取物IDS23(Rheuma-Hek)可抑制脂多糖刺激的单核细胞因子产生，呈剂量依赖方式，可抑制PHA体外刺激外周血单核细胞(PBMC)中Th1特异性IL-2和IFN-γ的生成，分别为(50±32)%和(77±14)%。相反，IDS 23可刺激Th2特异性IL-4的分泌(Klingelhoefer,1999)。
3.粘膜佐剂
       据估计，胃肠道、呼吸道和泌尿生殖道的总粘膜表面积为400m²，粘膜免疫系统补充的总淋巴细胞数比淋巴结和脾要多。粘膜免疫具有一些优点，如可避免针剂的疼痛、减少注射局部的炎症反应、易于重复接种、模拟病原体感染途径及可诱导局部IgA的生成及各种系统性B和T细胞效应等，这使得粘膜疫苗将成为疫苗发展的新趋势。但由于绝大多数非复制抗原只是在大量和反复接种后才可引起免疫应答，而且这些应答持续时间较短，即便是自然感染，所导致的免疫力持续时间也短于全身性感染，故粘膜佐剂的研究就显得格外重要。
       大肠杆菌热不稳定内毒素(heat labile enterotoxin,LT)和霍乱毒素(cholera toxin,CT)是目前最有效的粘膜佐剂。但是，这些分子应用于人类疫苗的毒性太大，而这些毒素通过定点突变修饰后产生的分子如LTK63具有佐剂活性，在一临床前模型中显示佐剂活性而无毒，通过基因细菌毒素脱毒产生新型佐剂的办法为未来粘膜疫苗的佐剂研究提供了重要途径(O'Hagan,1998)。
       由霍乱孤菌产毒株产生的闭合小带毒素(zonula occludens toxin,Zot)是一种新型微生物来源的有效粘膜佐剂^[10]，能够可逆性改变肠内上皮紧密连接，为大分子通过粘膜屏障提供通道，Zot可作为递送可溶性抗原通过鼻粘膜以诱导抗原特异性全身和粘膜免疫应答，可诱导与LT相似类型的抗原特异性IgG亚型，包括IgG1、IgG2a和IgG2b亚型。lymphotactin(Lptn)是主要由NK、CD8⁺T细胞γδTCR阳性(TCR⁺)上皮内淋巴细胞产生的一种C超化因子。研究表明，Lptn具有佐剂活性(Lillard等1999)。Lptn在粘膜中可能通过帮助Th1和Th2型细胞提供连接粘膜最初先天性信号与获得性免疫系统的，从而提高粘膜全身性抗体应答。
       含免疫刺激性合成CpG模体的ODN可作为BALB/c小鼠蛋白质肌内注射或鼻内吸入时的有效佐剂。CpG ODN和CT单独或一起作为粘膜佐剂与纯化的乙肝表面抗原(HBsAg)给予时，均可增强对HbsAg的全身性(体液和细胞)和粘膜免疫应答。CT单独诱导的抗体同位型主要为IgG1(Th2-like)，而CpG ODN单独或与CT联合使用时主要为IgG2a(Th1-like)型^[11]。结果表明，刺激性CpG ODN可作为粘膜接种策略中单独或与其它粘膜佐剂联合使用的新型佐剂(Horner等，1998)。此外，ISCOM、IL-12、MF-59等也可用作粘膜佐剂。
4.结合物型佐剂
       结合物型佐剂也可称为分子内佐剂。新型疫苗特别是人工合成的多肽绝大多数为小分子，免疫原性较差，与较大分子结合可提高其免疫原性。破伤风类毒素、绿脓杆菌毒素A、β-半乳糖苷酶、流感病毒血细胞凝集素等可成功提高肽的免疫原性。此外，肽与脂类共价融合的结合物免疫原性提高，特别是对CTL的诱导更有效，可不用其它佐剂。随着新疫苗的发展，联合免疫已是简化免疫程序、提高免疫范围和降低免疫成本所必需。联合疫苗抗原面临的问题有抗原性竞争和载体特异性表位抑制。为了成功使用联合疫苗，各种抗原的量要优化，采用有效佐剂使抗原的量减至最小。
       肽抗原是由甘露戊糖-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺结合物包被的脂质体，一次皮下接种即可诱导小鼠主要组织相容性复合体I限制性CD8⁺ CTL应答(Fukasawa M,1998)。甘露聚糖也可提高脂多糖(LPS)的佐剂性，部分作用可能与刺激巨噬细胞有关，因为后者具有甘露聚糖结合的受体。MeKenzie等的研究显示，抗原与甘露聚糖的结合非常重要。与甘露聚糖的结合非常重要。与甘露聚糖偶联的蛋白质可引起较好的细胞介导免疫应答。Apostoulopoulos等用小鼠进行的研究表明，抗原与甘露聚糖的结合是在氧化条件下进行的，生成的共轭聚合物可选择性刺激Th1应答，并出现良好的DTH和显著的CTL产生，但抗体滴度较低而T细胞主要分泌IFN-γ。还原条件下，结果相反：此聚合物刺激Th2应答，IL-4和IgG1抗体的生成，而CTL应答水平很低。
      多糖与蛋白质结合可提供多糖的T依赖性特征，以便对新生儿具有免疫原性，产生记忆应答。作为FCA的替代品上市的adjuprime是一种糖类聚合物，可产生储存库作用和提高抗原与抗原递呈细胞之间的相互作用。肽-磷脂合成物(peptide-phospholipid conjugates)也称为“脂蛋白体”，当含有编码B细胞和辅助性T细胞表位的肽与磷脂共价连接时，可刺激高水平抗体滴度和CTL。其免疫原性的重要特征是两亲性，诱导CTL的表位肽和辅助性T细胞表位肽与磷脂形成复合物，可诱导多种动物病毒系统的CTL活性和粘膜免疫。由13个氨基酸非自然pan DR表位(PADRE)和糖类B细胞表位形成的线形糖类-肽构成物是有效免疫原，可有效提供糖类特异性抗体应答的T细胞辅助，作为预防和治疗性疫苗的较复杂载体的替代物。不同佐剂与PADRE结合物合用，可实现对所产生抗体同位型的调节^[12]，如铝盐产生IgG1型，而QS-21增强IgG2a、2b型，铝盐/QS-21混合物产生均衡的IgG1/IgG2b型同位型。
    综合上所述，目前人用疫苗佐剂研究的新超向包括APC佐剂、T细胞佐剂、粘膜佐剂及结合物型佐剂的研究，它们从不同方面对综合解决佐剂的有效性与安全性问题展开研究。尽管人用疫苗佐剂研究中仍存在不少问题，随着对佐剂作用的分子机制、细胞因子的作用及参与免疫应答的不同类型细胞的认识深化，以及对免疫与各种疾病的关系进一步了解，人用疫苗佐剂将为人类健康作出更大的贡献。

参考文献

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