长篇综述：哺乳动物MAPK途径简述（二）

第2部分 哺乳动物MAPK途径的组织

     哺乳动物中对MAPK途径的研究，多采用过表达、显性失活、基因敲除等方法。目前，已发现了4种类型MAPK途径，它们以途径的核心－MAPK命名，参与了多种细胞生理活动的调节。

首先应强调两点：

     1 许多途径成员都以几种不同形式的异构体存在，每种异构体还有多种剪切方式，更增加途径的复杂性。

     2 各条MAPK途径并不是僵化的，许多成员都具有交叉性（见图一）。没有任何一条途径在细胞的某种反应中是独立存在的，每条途径都可以和许多其它途径相整合，它们的强度、相互作用、整合结果决定了细胞的命运。

图一 哺乳动物细胞MAPK途径

2.1 MAPK^erk途径（ERK途径）

     这是脊椎动物中克隆的第一个MAPK途径，也是阐述最完全的经典途径。

2.1.1激活因素及上游分子的募集
 
     ERK途径的激活多由细胞表面受体激活引发。这些受体包括：生长因子酪氨酸激酶受体（EGF受体、PDGF受体、胰岛素受体）、细胞因子受体、TCR 、CD28、BCR、G蛋白偶联受体等等。整联蛋白的聚集也可引发这条经典途径。

     ERK途径最主要的激活信号来自酪氨酸激酶受体。以EGF受体为例，自身酪氨酸磷酸化激活之后，接头分子Shc通过其PTB结构域结合于受体特定的磷酸化酪氨酸上，被受体激酶磷酸化(10)。Shc磷酸化激活后，又通过其SH2结构域结合另一接头分子Grb2。而Grb2已通过其SH3结构域与 Sos（鸟苷酸交换因子）稳定结合。这样，受体自身磷酸化激活就召集了Sos分子。Sos与受体的结合使质膜Ras·GDP转换为Ras·GTP，Ras分子与MKKK^raf1相作用，激活了ERK级联反应途径（11）。（见图二）

     没有激酶活性的细胞因子受体通过召集胞内激酶如Lck、Fyn、Lyn使自身磷酸化，引发相同的反应，通过Ras·GTP这个重要分子激活ERK途径(12)。JAK也可以激活此途径。目前发现，JAK的作用体现在两个水平：磷酸化Shc接头分子(13)、直接磷酸化MKKK。（见图二）

     这些上游分子的募集对于不同信号激活MAPK途径是非常重要的。但也并不是所有的ERK途径都必需Ras的参与，最近的一项研究表明，在IL-3依赖的小鼠前B细胞株Ba/F3中，42℃热击可以激活一条未知的不需要Ras激活的ERK途径(14)，这同时也证明ERK途径也可以介导一些应激刺激信号。

2.1.2 三酶模体构成

MKKK：Raf1、A-Raf、B-Raf、Mos、MEKK1、MEKK2、MEKK3、Tpl-2
MKK： MEK1、MEK2 
MAPK：ERK1、ERK2 
MKKK：以Raf-1为例，其N端调节结构域与上游分子膜蛋白Ras·GTP作用，结合于质膜，Tyr340和Tyr341被膜上的酪氨酸激酶如c-Src等磷酸化激活(10)(11)。此过程详细机理还不十分清楚。Raf-1同时在Ser43、Ser259、Ser499、Ser621、Thr268均被磷酸化，实验证明可能是由PKC介导的(15)。

     Raf-1还受其它蛋白调节(16)，例如可被14－3－3蛋白激活，被PKA下调。这提供了MAPK^erk途径与其它相关途径在上游整合的证据。

     MAPK途径其它成员也可调节Raf-1活性：下游激酶MEK1可以激活Raf-1，正反馈放大信号(17)。而同是下游激酶的ERK1/2则发挥抑制作用，负反馈调节信号强度。

MKK：MEK1和MEK2高度同源，许多实验结果表明，它们在不同的细胞体系中，不同的胞外信号作用下，分别受到Raf-1、A-Raf、B-Raf不同的调节。

     同时MEK作为双功能激酶双磷酸化ERK1/2。MEK中存在NES（排斥入核序列）(18)，在非激活状态下，MEK与ERK结合，迫使ERK驻留于胞质。

MAPK：ERK1/2内部模序“TEY”被双磷酸化激活之后，与胞质激酶MEK脱离，可以转位入核，调节一些转录因子功能。作为一个Ser/Thr蛋白激酶，磷酸化底物“Pro-Leu-Ser/Thr-Pro”模序(19)。底物距磷酸化位点＋1位的脯氨酸对ERK和底物的相互作用非常重要，它介导了二者相互作用。ERK双磷酸化激活后，构象变化，形成特异于脯氨酸的分子表面口袋。

     双功能磷酸酶MKP-1、MKP-3、MKP-4特异性下调ERK。ERK去磷酸化失活后，又转位出核，回到胞质与MEK重新结合。其中，MKP-3和MKP-4定位于胞质，提示了MKP-3、MKP-4对ERK途径下调具有特殊的机制。

2.1.3作用底物
     由于ERK激活之后可以转位入核，ERK1/2的底物也分别定位于胞质中、核中。

胞质中：ERK1/2苏氨酸磷酸化激活p90rsk激酶。p90rsk随后转位入核，磷酸化c-Fos(Ser362)。同时磷酸化抑制GSK3活性，减弱了GSK3对c-Jun的负调作用，放大了ERK的信号(20)。

     磷酸化激活磷脂酶A2(21)，加速其催化反应（类二十烷酸合成中的限速步骤）的进行，提高了参与细胞了许多重要的生理现象的调节分子－花生四烯酸的合成。

     ERK1/2还可以磷酸化抑制途径上游分子。它们包括：EGF 受体、Ras交换因子Sos、Raf-1、MEK。这些分子都参与了对ERK的调节，ERK对它们的影响体现了一种负反馈机制(22)。

核中：Erk1/2核中的底物多为转录因子。它转位入核磷酸化激活的转录因子包括：Elk1、Ets1、Sap、c-Myc、 Tal、STAT。而对Myb，则发挥抑制作用。

     在这里，简单介绍一下ETS转录因子家族(23)，它的许多成员都是MAPK途径的重要底物。在对Ras－Raf－MAPK途径的研究中，ETS家族不断有新成员被发现。这是一个非常古老的转录因子家族，和MAPK途径一样进化保守。

     这个家族所有成员的共同点是拥有一个ETS结构域，负责与DNA序列以单体形式相结合。ETS 结构域形成一个wHTH结构，识别并结合核心区为GGAA/T的10碱基序列，称之为EBS。根据ETS结构域构象和位置不同，ETS家族分为多个亚家族。（见图三）。它们都具有N端保守调控区NCR，MAPK正是通过磷酸化NCR中一个Thr残基，特异性地激活ETS。

     值得一提的是，ETS转录因子家族激活后对特定基因表达的调节是通过与其它种类的转录因子在DNA元件上形成某种特异的复合物实现的。目前已发现有多种此类复合物，例如：EBS位点结合的“ETS－AP-1”复合物，SRE位点结合的“SRF－TCF”复合物，组织特异的Ras反应元件结合的“ETS-1－Pit-1”复合物等等（见图四）。

ETS转录因子家族四大特点决定了它们对特定基因表达调节的专一性：

（1） 家族成员在不同组织、细胞种类中表达具有很大差异，限制了被调节基因的种类。

（2） 每个家族成员都具有其特异性结合序列，对靶基因选择非常严格。

（3）与其它特异性蛋白因子相互作用。

（4）与其相作用的蛋白因子也受到MAPK途径的特异磷酸化调节。

     ETS转录因子家族在MAPK信号途径下游发挥着非常重要的作用，它的许多成员都与细胞转化相关，并关系到人类疾病(24)。这也从侧面反应了MAPK途径的重要性。

图三 ETS转录因子家族成员

2.1.4 ERK途径功能

培养细胞中，ERK途径与细胞的增殖相关。但ERK途径对增殖促进或抑制，因细胞而异，因它在不同的细胞环境中激活的基因而异。

     EGF、RDGF等细胞生长因子可以强烈而持久地激活此途径。对MKKK分子Raf1功能的干扰对细胞增殖有明显的抑制，而MEK1的持续激活可促进细胞生长。胞内激活的ERK分子一半结合于胞质骨架上，暗示了它与增殖中胞质骨架的重新组织有关。

     但在另一些细胞环境中，它的激活对细胞增殖却有明显的抑制作用。例如在平滑肌细胞中ERK途径的激活引发的PGE2的释放抑制了细胞增殖。

在一些特定的细胞中，ERK途径还可以介导分化信号。

     在PC12细胞中，神经生长因子NGF诱导的MEK1和ERK2分子的持续激活可诱导细胞分化。

     同样在PC12 细胞中，生长因子EGF和神经因子NGF都可以激活ERK途径，为什么EGF可促进细胞生长，而NGF却介导了抑制细胞增殖的分化信号(25)？区别在于它们对相同的ERK途径激活的时间和强度不同。EGF对这条途径是短暂激活，NGF引发的激活是持续的。总而言之，ERK途径激活的时间、强度不同，效果迥然而异。

ERK途径参与了细胞周期调节。Cyclin D1的转录依赖于ERK的持续激活和核内滞留。在中国仓鼠卵巢细胞中，ERK1/2在G1期和M期被激活，并定位于微管组织中心(26)，但它的下游底物还未发现。

ERK途径的激活可以抗凋亡。目前已发现途径两个成员与凋亡相关：ERK与B-Raf。在L929细胞中，ERK的激活削弱了TNF-α诱导的凋亡信号(27)。在Jurkat细胞中，它的激活又对抗了Fas诱导的凋亡信号(28)，但这种对抗很弱，而且很快就被凋亡引发的Raf1降解削弱了。小鼠基因敲除实验证实B-raf是血管系统发育的关键分子(29)，它的功能推测为保护成熟的红细胞抵抗凋亡。

2.2 MAPK^jnk 途径（SAPK/JNK途径）

     1991年，发现了这条途径核心MAPK－JNK，它与ERK有两大区别： 可被多种应激刺激激活、磷酸化转录因子c-Jun N端激活位点（ERK磷酸化其c端抑制位点）。当时，此激酶在人和大鼠中同时被发现，分别被命名为JNK（c-Jun N端激酶）和SAPK（应激激活蛋白激酶）(30)(31)。随后又发现了JNK家族的其它成员。

2.2.1 激活因素及上游分子募集

     这条途径的特点之一就是可被多种应激因素激活：热击、γ射线导致的DNA损伤、过氧化物体的产生、高渗等等。

     同时，和ERK途径一样，它也可被多种类型的细胞表面受体激活：TNF受体家族、GPCR、酪氨酸激酶受体、细胞因子受体都可激活JNK途径。更多的激活因子仍在探索中。

     Ras对JNK途径的激活只可达到1/3。而其它小分子量GTP结合蛋白家族成员Rac 和Cdc42却是JNK途径的强激动剂，它们也可与Ras相协同，最大限度地激活JNK途径。实验证实，舒缓肽等G蛋白偶联受体可以激活Cdc42，生长因子酪氨酸激酶受体EGF可激活Rac，Rac结合并激活下游分子PAK65/PAK1（MKKK），传递特异信号(32)（见图一）。

2.2.2 三酶模体构成

MKKK：MEKK1、MEKK2、MEKK3、MEKK4、TAK1、MUK、Tpl-2、SPRK、 ASK1、MST
MKK： MKK4、MKK7 
MAPK：JNK1、JNK2、JNK3

     JNK目前已发现三种，分别由三个基因编码(33)，JNK1和JNK2在体内广泛存在，JNK3只存在于脑中。三个基因不同的剪切方式共产生了10种异构体，关于它们在体内的表达方式还没有系统研究。但已发现异构体受到不同的调节

     JNK也是被双功能激酶MKK4、MKK7双磷酸化“TPY”模序激活。被特异性双功能磷酸酶M3/6、MKP-1去磷酸化失活。

     JNK途径中一个重要的分子是JIP-1(34),它作为JNK的抑制因子在小鼠中被发现，可以抑制JNK对转录因子的激活。JIP-1 中存在一个JBD结构域（JNK 结合结构域）。这个结构域可抑制多种JNK的功能，包括激活c-Jun和Elk-1、参与NGF去除引发的凋亡等等。JIP-1也是JNK的底物之一，它的许多功能也可被JBD抑制。最近，JIP-1的大鼠同源蛋白IB-1被发现(35)，有研究者推测JIP-1是它截短的异构体。

2.2.3 作用底物

     JNK对底物具有双重识别机制。首先和其它MAPK一样，它识别底物的“Ser/Thr-X-Pro”模序并将其磷酸化，但仅有这一个序列是不够的。证据是具有此序列的JunB不能被JNK有效地磷酸化。有效的磷酸化还需要一个另外的锚定序列。例如c-Jun分子锚定模序的存在加强了与JNK结合，有效地提高了JNK的局部浓度，并指导着JNK对N端的磷酸化。又因为c-Jun可以和AP-1转录因子家族其它成员形成二聚体，它对JNK的锚定为其它没有锚定模序的转录因子被JNK磷酸化提供了一个平台(36)。

     JNK和ERK不同之处还在于它没有胞质底物，它的底物均为核内的转录因子。它们是：c-Jun、ATF-2、Elk-1、p53、DPC4、NF-AT4。

     以c-Jun为例，JNK磷酸化它的Ser63和Ser73，增强了Jun/Jun同源二聚体和Jun/ATF2异源二聚体的形成，也增强了c-Jun 抗泛肽降解的能力(37)。因此，JNK不仅可以激活转录因子，而且可以提高它们的稳定性，从而促进目的基因表达。

     但也有相反的情况。JNK磷酸化转录因子NF-AT4抑制其入核发挥作用。(38)。证据是其磷酸化位点的突变，可以使NF-AT4持续性激活，并滞留于核内。

     JNK对Elf-1的激活，则体现了JNK途径与经典ERK途径的会聚。

2.2.4 JNK途径功能

与细胞凋亡相关。生长因子缺乏、应激刺激、DNA损伤、凋亡因子Fas在细胞表面的连接引发的凋亡信号都有JNK途径的参与。对途径中关键分子如MKK-4、c-Jun 功能的干扰可以在某种程度上抵抗凋亡。

     目前已发现，前凋亡蛋白FasL的表达需要AP1转录因子复合物的参与，需要JNK途径的激活，这是JNK途径与细胞凋亡途径之间最直接的联系(39)。

     小鼠基因敲除实验证实JNK3与红藻氨酸诱导的癫痫相关。癫痫的放电性发作程度反应了脑部海马区细胞的死亡数目。JNK3的基因敲除小鼠对作用剂量的红藻氨酸没有癫痫发作反应，究其原因是海马区没有细胞死亡。这是目前发现的JNK分子与细胞凋亡相关的最好证据(40)。

在一些情况下，JNK途径也参与细胞存活和生长调节(41)。

     BAF3前B细胞中，JNK途径与IL-3诱导的细胞增殖有关。T98G细胞中，它又参与了对DNA损伤的修复。

     另有证据表明，在T细胞中，JNK途径的激活和TCR与CD28的信号整合相关。两个受体的共同作用激活了JNK途径，参与细胞因子IL-2表达调节。一些证据表明，通路为PKCtheta→calcineurin→CDC42→MEKK1→SEK1(42).