RNA与X染色体失活的后成调节（上）

徐丰
（中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所）

关键词: X失活特异转录物 X染色体失活中心 X控制元件 Tsix

摘 要
    在哺乳动物中，剂量补偿是通过X染色体失活来达到的。X染色体失活是指哺乳动物二倍体细胞中除保持一个活性X染色体，其余的X染色体全部失活。这个过程是由X染色体失活中心(Xic)和Xist基因顺式调节的。Xic控制X染色体的计数和选择，并且起始X失活。Xic的作用表现为Xist RNA的性质，从分散且不稳定的RNA 成为高表达的Xist RNA,并且覆盖未来的失活X染色体。Xist下游的一段65kb区域缺失会导致持续的Xist表达和X失活，暗示这段区域中有重要的顺式调控元件。在这段区域里，新发现了一段与Xist反义的基因--Tsix，它起始于Xist下游15kb，跨越了整个Xist区域，其转录产物是一段40kb长的RNA。Tsix序列处在人Xic中，Tsix RNA没有开放阅读框架(ORF)，只在核内可以观察到并且定位于Xic。Tsix的特性表明它在X染色体失活的最初步骤中有作用，而在失活X染色体的步骤中没有作用。

简介
    在生物体内,由于性别的差异,两性细胞中的X染色体数目是不同的。为了平衡具有不同X染色体数目的细胞中X连锁基因的表达量，生物体在进化过程中引入了剂量补偿机制(Dosage compensation)。在线虫中，两性体的染色体浓缩和分离与一组蛋白复合体有关，这组蛋白在两个X染色体上集结并通过其中一个蛋白因子的作用减少X连锁基因的表达[1]；在黑腹果蝇中，一种RNA－蛋白复合体与雄性细胞的单一X染色体结合，刺激X连锁基因产生两倍的表达量[2]；而在哺乳动物中，两性细胞间X连锁基因的表达平衡是通过雌性细胞内一个X染色体的失活来达到的[3]。这样,哺乳动物就必须拥有比无脊椎动物更加复杂的调控机制,以便在多个X染色体中选择一个保持活性并失活其余的X染色体。尽管各种生物实现剂量补偿的机理各不相同，但有两点是相同的：1，剂量补偿机制起始于胚胎发育早期。2，X连锁基因的表达是受稳定增殖传播的染色质修饰调节的。

    X染色体失活是指哺乳动物二倍体细胞中除保持一个活性X染色体，其余的X染色体全部失活。X染色体失活现象早在1961年就已经得到了报道 [4] 。 1991年，研究人员发现并克隆了人X失活特异转录物（X-inactivion specific transcript, XIST）基因和它的同源基因鼠Xist基因[5－7]，这极大地促进了此项研究的进展。通过荧光原位杂交（Fluorescent in situ hybridization, Fish）方法，研究者发现在失活的X染色体表面有颗粒状RNA覆盖[8,9]。由此，RNA在X失活中的作用引起了人们广泛的兴趣。

    X染色体失活牵涉到三个主要步骤：1.选择 2.起始 3.传播。在胚胎发育的早期，也就是当胚胎细胞从全能细胞开始分化的时候，X染色体失活的选择和起始过程就已经开始了。X染色体失活从X失活中心(X inactivation centre,Xic)起始并双向传播至整个X染色体。Xist基因就定位于X失活中心，其特异转录物是一个剪接过的大分子非编码RNA，长约15kb,它在雌性体细胞的失活X染色体上特异地大量表达。Xist基因在常染色体上的转基因易位表达可使常染色体特异失活[10,11]，说明Xist是X失活的充分条件,而Xist基因的缺失实验进一步证明了Xist是X失活的必要条件[12-14]。

Xist与X染色体失活的选择
    Xist基因表达的变化与X失活的选择密切相关。在即将发生X失活的胚胎细胞中，雄性细胞的单一X染色体和雌性细胞的两个X染色体上均可检测到Xist基因的转录[15]。但是，这种Xist RNA并不稳定而且只能在转录位点检测到。当X失活起始时，从将要被失活的X染色体上转录而来的Xist RNA得到了稳定并且顺式传播，覆盖X染色体，完成X失活[16,17]。最后，另一个有活性的X染色体上不稳定的Xist RNA的转录活动沉寂了。从分子的角度上来说，X失活的选择以阻断活性X染色体上Xist RNA的稳定和传播的方式得到了表现。有研究者认为,在X失活的选择和起始过程中,有两种常染色体编码的蛋白因子起到了重要作用，称为稳定因子(stabilizing factors)和阻断因子(blocking factors)。稳定因子在失活X染色体上稳定Xist RNA并介导其与X染色体的作用，而阻断因子则与活性X染色体上的X失活中心作用并阻断Xist RNA的表达，阻断因子在每个二倍体细胞中的数量是有限的，只够在一个X失活中心集结并发挥作用。Xist序列的甲基化对于活性X染色体上Xist表达的沉寂是必须的，因为在DNA甲基转移酶缺陷型细胞中，Xist RNA可以覆盖并调节已分化的雄性细胞中唯一的X染色体和已分化的雌性细胞中的两个X染色体同时失活。这是因为，没有DNA甲基化的正常调节，活性X染色体上的Xist转录不能停止，X ist RNA会导致活性X染色体的失活，这些结果说明，稳定Xist RNA的蛋白因子在雄性细胞中也有表达，并不一定需要有多个X染色体才能诱导其表达。

    一般来说，X失活在胚胎细胞系中是随机的，表明阻断因子在两个X失活中心的作用机率是相等的。但是，在鼠杂合体中，有一段称为X控制元件（X controlling element, Xce）的序列与Xist 基因紧密相连，这段序列导致了X失活的偏向，这证明顺式作用元件能影响阻断因子与X失活中心的作用机率。另外，在一个与X失活偏向性有关的XIST启动子突变实验中，带有突变的X染色体被优先失活[18]，表明X控制元件可能是通过调节XIST基因转录起作用的。Xce有强、弱两种。如果两个X染色体带有相同的Xce等位基因，那么X失活是随机的；如果一个X染色体带有弱Xce等位基因，而另一个X染色体带有强Xce等位基因，则X失活就会发生偏向，前者的X失活机率要比后者的大。这可能是在Xce影响下Xic对于阻断因子的动力学竞争的结果。(图1) 上述事实暗示：在一个细胞核内，所有的X失活中心竞争以获得与阻断因子相作用的机会，X失活中心与阻断因子的亲和性则是由胚胎细胞Xist转录的某些方面决定的。

图1 X失活起始中Xist基因表达调控因子的作用

    另外，在有袋类哺乳动物和鼠胚胎外组织的X失活也不是随机的，雌性细胞中父系的一个X染色体被专一性失活。有袋类动物的X失活机理可能与Xist无关[19]，鼠胚胎外组织的X失活则需要Xist，但是这两种特异父系X失活的机理是否相同仍有待研究。
Xist基因中的一些序列也可以影响X失活的选择过程，有实验证实一段6kb 的Xist序列在X染色体的失活选择中起到了决定性的作用。

Xist与X染色体失活的起始
    染色体失活是由一系列Xist基因表达模式的改变所调节的。在未分化的雌性胚胎干细胞内，两个活性X染色体均能以低水平表达Xist，当细胞分化开始后，X失活也随之起始。X失活在胚胎细胞系中的起始早于囊胚期，约在胚胎发育的第5天左右[20]。这时，两个Xist等位基因的表达也出现了差别，一个位点的Xist RNA出现了高表达并且与失活X染色体顺式相连，另一个位点的Xist基因表达量仍保持低水平，带有这个位点的X染色体就成为活性X染色体。最后，当胚胎细胞分化至8.5天以后，活性X染色体上的Xist启动子沉寂了，仅可检测到与失活X染色体相连的Xist RNA。也就是说，在胚胎细胞分化过程中，雌性细胞经历了一个低水平双等位Xist基因表达→分化双等位Xist基因表达→高水平单等位Xist基因表达的过程。(图2)

图2 雌性胚胎细胞Xist基因表达的过程

    在雄性胚胎干细胞和雌性成纤维细胞中均只有一个活性的X染色体，它们之间Xist RNA转录速率的比较结果证实: 在Xist 基因的低水平和高水平表达细胞之间,Xist RNA转录速率相差无几。这意味着从低水平Xist表达向高水平Xist表达的转变与Xist基因的转录活性无关。另外，这两种细胞间的未剪接Xist RNA的充裕程度和半衰期也基本相同。然而，这两种细胞间剪接后Xist RNA的积累和稳定程度却大不一样。这说明在Xist基因的低水平和高水平表达细胞之间最大的不同是的剪接后Xist RNA 的积累，是失活X染色体上的Xist RNA的转录后稳定过程导致了剪接后Xist RNA的增加。对于这种现象最简单的解释是有一些蛋白因子与Xist RNA相作用并调节其与失活X染色体的联系。在雌性体细胞内XIST/Xist RNA的颗粒状外观也暗示着覆盖于失活X染色体上的RNA是与附加的因子相联系的。另外，在黑腹果蝇的剂量补偿机制中RNA－蛋白复合体的作用也暗示这种假说的正确性[21-23]。

    X失活的过程含有三个调节Xist基因表达模式所必须的动作：失活X染色体上稳定因子对Xist RNA的稳定；将稳定因子限制于失活X染色体上；活性X染色体上Xist基因表达的沉寂。这三个动作是由多能胚胎细胞的分化所诱导的，在其中起重要作用的阻断因子的产生也是短暂的。

    Xist RNA稳定因子散布于细胞核，在已分化的雌性细胞中专一作用于一个X染色体。这种专一的作用可能是通过两种方式完成的：阻断稳定因子与活性X染色体的接近或是将稳定因子特异定向于失活X染色体。由于X失活是遵循n-1规则进行的[24]，也就是说在每个二倍体细胞中仅有一个X染色体保持活性，其余X染色体均被失活，所以第一种机理可能性更大。低水平的Xist 表达可能仅在缺乏稳定因子的情况下发生，而阻断因子将在X失活起始后阻断稳定因子与活性X染色体上Xist RNA的作用。将阻断因子的作用限制于一个X染色体的机理仍不清楚，可能阻断因子是一种由常染色体编码的可扩散的因子，其数量仅足以在两倍体细胞中的一处Xist位点集结并发生作用。（待续）