RNA与X染色体失活的后成调节（下）

徐丰
（中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所）

(续前）Xist 与X失活的传播和维持
    雌性体细胞中覆盖于失活X染色体上的Xist RNA外观呈簇集颗粒状，其功能不受DNA酶和RNA酶H的影响，这暗示着Xist RNA并未与DNA接触，有学者认为，是RNA－蛋白相互作用中介了Xist RNA和染色体之间的顺式传播与联系。在YAC转基因实验中，从常染色体上转录而来的Xist RNA可以传播并导致Xist基因连锁的常染色体序列的沉寂，表明X染色体特异元件在Xist的传播和异染色质化的过程中并不必须。

    在随机和非随机的X失活过程中，Xist RNA的传播处在X染色体失活之前[25]，这暗示有一些在Xist RNA的稳定和传播之后发生作用的因子是X失活所必须的。在胎生和有袋类哺乳动物中，失活X染色体晚至S相复制，并且组蛋白H4的乙酰化异构体数量也有所下降，所以，Xist RNA的传播可能延迟了失活X染色体复制的起始，在雌性胚胎干细胞的分化过程中,X染色体复制延迟、Xist转录物得到稳定，这与X连锁基因表达的下调和低乙酰化X染色体的出现是一致的。Xist RNA可能是通过使失活X染色体在S相复制起作用的，这同时导致了在较晚复制的染色体上异染色质的形成[26]。Xist RNA也可能在失活X染色体的组蛋白乙酰化调节中起作用，它可以阻碍组蛋白乙酰化转移酶的作用或召集组蛋白去乙酰化酶。

    XIST并不足以维持体细胞杂交体中X染色体的失活，同时，XIST也不是X失活的维持所必须的，在X失活的维持中起主要作用的是DNA的甲基化。

Tsix在X染色体失活中的作用
    Tsix是最近发现的,起始于Xist基因下游的Xist反义基因,其转录产物很有可能是Xist的调节子[27]。正如Xist RNA，Tsix RNA完全分布于核内，在X失活的过程中受到动力学调控，在X失活之前，Tsix在核内是双等位基因表达的；但在X失活开始后，Tsix则在未来的活性X染色体上特异地单等位基因表达，这也暗示了Tsix RNA抑制Xist RNA积累的可能性。

    Lee等定向地缺失了Tsix基因5’端一段长3.7kb的富含CpG的区域。缺失突变导致长达40kb的Tsix基因完全的表达缺陷[28]，这个结果与这段区域是转录启动子的猜测相符合。而且支持Tsix基因编码单个40kb反义RNA而不是几段较小的RNA的观点。缺失突变损害X染色体的选择而不会影响X染色体的计数和失活过程。这个结果证明X染色体的计数和选择在遗传学上是分离的。尽管这3.7kb的缺失并不影响计数，Tsix内的其它顺式元件仍有可能影响计数过程，这有待于进一步的Tsix基因敲除实验证实。

    在XX雌性细胞内对CpG缺失突变(△CpG)的分析说明Tsix是X染色体的随机选择所必须的。Tsix RNA 完全是通过阻止Xist积累的方式顺式作用于将要保持活性的X染色体。有趣的是，尽管Tsix在分化中的雌性细胞内有抑制功能，它在未分化的细胞内没有可观察到的功能。尽管在未分化细胞内Tsix也有表达，但Tsix基因的缺失并不导致突变的X染色体上Xist的积累，只有少量稳定态Xist RNA的升高，这暗示除了Xist和Tsix以外还有其它的一些反式因子是X失活所需要的(如竞争因子)。

    重要的是，现有的研究无法识别CpG缺失的作用是由Tsix RNA不能表达引起的，还是由于某一重要的DNA元件（如所谓的阻断因子的结合位点）缺失所引起的。如果是因为这段DNA序列是重要的顺式元件，那么就很难说这种基因敲除的现象是特异地与Tsix基因有关还是因为敲除区是Xist的3’顺式调节元件。基于Tsix RNA缺陷导致未分化细胞中稳态Xist RNA上升和顺式Xist RNA大量上调，倾向于Tsix RNA本身是功能性的。Tsix RNA通过RNA双链形成和定向降解可以负调节Xist RNA的稳定性。另一种可能是，Tsix RNA 覆盖Xist RNA的染色体结合位点以阻止它覆盖X染色体。

    已有的遗传学证据与Tsix在调节Xist和X染色体的选择中的作用相符合。Tsix基因部分位于一段65kb长的含有所谓Xist抑制元件的区域[29]，也完全地处于一段80kb长的序列中，这段序列据信是含有对Xic功能有重要作用的顺式元件，包括那些与X染色体选择有关的顺式元件 [30].转基因实验也显示一个无Tsix 功能的35kb长的Xist粘粒可以异位表达Xist,并且使一个连锁的报告基因不能表达[31],这个结果支持Tsix缺陷会导致Xist表达升高的结论。最后，CpG缺失突变切除了一个在Tsix基因中的CpG岛，这个CpG岛的甲基化状况与Xce的强度有反比关系[32-33].含有强Xce等位基因的X染色体的Tsix基因的5’端这个区域的甲基化减少，与Tsix表达能阻止Xist表达增加的作用一致。因为CpG缺失会影响X染色体的选择，确定Tsix是否与Xce有同样作用是很重要的。

    最近的一项包括Xist外显子1-5的基因敲除实验指出,一个选择元件存在于这个Xist区域。因为Xist的外显子1-5与Tsix重合,这个突变体之所以丧失了选择功能反映的更有可能是Tsix受损而不是Xist.也有可能有两个顺式元件都是选择所必须的,一个处于Tsix的5’端,另一个处于Xist内部。另外，在人类细胞中，Xist启动子内的一个突变与非随机X失活有关。因此，可能有多种因素通过上位或平行途径控制选择过程。

    CpG缺失突变的表型与切断Tsix的65kb基因敲除突变的表型相比较，两种基因敲除都会导致XX细胞中非随机的X失活。然而，CpG缺失突变在XY细胞中不起作用，而65kb基因敲除则仍会使XY细胞中的X染色体失活，甚至在只有一个完整X染色体的突变体细胞 (“XO”细胞) 中也会导致X失活。出现这种结果的原因可能有以下几点：第一，CpG缺失所占的区域比65kb基因敲除的区域小很多。65kb基因敲除的区域包括除Tsix之外的数个基因，如睾丸特异基因Tsx,Xist的3’端（外显子7）和脑特异基因Brx。另有一个Xist抑制元件也可能处于这段65kb区。另一个原因是，“XO”细胞系是由杂合体65kb基因敲除XX胚胎干细胞系衍化而来的,有可能计数在克隆“XO”衍化细胞系之前已发生了。甚至还有可能原有的XX胚胎干细胞系是从一个已经计数过的胚胎衍化而来的。最后一个原因是“XO”细胞系中的一个X染色体被破坏并且丢失了野生型X染色体的一部分(X△), X△丢失了Xic位点但仍保持邻近的序列。另一个X染色体上缺失了65kb(X65kb)。这样X65kbX△细胞系与X△CpGY细胞系并不完全等同。因为带有两个X染色体的片段，X65kbX△在遗传学上更类似于雌性细胞而不是雄性细胞。因此，X65kbX△细胞可能会在尚未鉴定的“竞争因子”的作用下发生X失活。

    竞争因子的假说得到了一个关键性结果的支持，这就是X失活在未分化的突变雌性细胞和已分化的突变雄性细胞中不会起始。这指出另有一个途径调节Xist并且这种途径与Tsix和CpG序列无关。为统一已有的遗传学实验结果， Lee等提出Xist由正、负两种因子通过平行的途径调节。(图3),已建立的模型提出细胞可以产生两种因子，一种是“阻断因子”(负因子)，另一种是“竞争因子”(正因子)，阻断因子通过阻断Xic的方式来标记未来的活性X染色体。阻断因子是一个由X连锁和常染色体编码的各种反式因子形成的复合物，其数量是一定的，一个二倍体细胞中只有一组。因为阻断因子是有限的，所以在每一个二倍体基因组中，只有一个X染色体保持活性。CpG缺失的影响同时暗示着阻断因子可能是通过Tsix起作用的。

图3 计数和选择的一个模型
（A） 选择活性和非活性X染色体的平行途径
（B） 在XY雄性和XX雌性细胞中的结果

    竞争因子在X失活的起始中是必须的，它可以在未来的失活X染色体上上调Xist RNA。根据经验,竞争因子在XO和XY细胞中并不出现，而在XX，XXX，XXXX细胞中存在。说明这种正因子只在每个二倍体基因组中含有多于一个X染色体的情况下表达。因为常染色体的组成是一致的，所以这种重要的因子一定是出自多余的X染色体。竞争因子是由X连锁的因子组成的(可能与在阻断因子中的那些因子一样)，但代表那些未被常染色体因子结合掉的部分。这样，XY细胞不产生竞争因子(一个X染色体)，XX细胞产生一个竞争因子(一个多余的X染色体)，XXX细胞产生二个竞争因子(二个多余的X染色体)，XXXX细胞产生三个竞争因子(三个多余的X染色体)。这个模型与多个遗传学实验的结果一致，另一些实验结果也支持有一种正因子控制未来失活X染色体的选择。推论中的竞争因子解释了为什么X△CpGY雄性细胞尽管没有Tsix，仍不能起始X染色体失活。相反的，X65kbX△雌性细胞起始X失活，可能是因为X△染色体上保持着能产生竞争因子的元件。
在雌性细胞中，Xist和Tsix的动力学关系如下：1，在X失活开始之前，Xist和Tsix是双等位基因共同表达的。2，在X染色体失活开始时(分化)，Tsix变为单等位基因表达，在未来的失活X染色体上表现为Xist表达上调。3，在单等位基因表达形式中，Tsix RNA只与未来的活性X染色体相连系。4，一旦X失活已经建立，Tsix表达被抑制。Tsix的表达对未分化细胞是特异的，而与性别无关，在X失活开始时短暂保持，在X失活建立后消失。这些结果表明Tsix可能调节X失活起始时的一些事件。由于它是与Xist RNA反义的，有可能Tsix RNA直接阻断Xist RNA在X染色体上的作用。

    尽管XIST/Xist 在X染色体失活中的重要性不容质疑，但是细胞通过何种分子机理起始和传播X失活仍是一个迷。对于假说中的阻断因子和稳定因子的确认十分重要[34]，将会极大地促进Xist RNA在X染色体上的集结机理的研究，也可能为X染色体失活的生物化学机理研究提供进一步的证据。最近的研究成果，包括Xic序列的必须性和Tsix作为遗传调节者的作用可能大大加快X失活机制的研究进程。
参 考 文 献
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