抑癌基因PTEN：结构，功能及参与的信号传导（中）

（续前） PTEN是一个肿瘤抑制基因
    PTEN定位于LOH高发区10q23，在肿瘤中存在着广泛的突变表明：PTEN功能的发挥是细胞正常发育所必需的，其失活将导致细胞的癌化。基因转染和基因敲除（gene knockout）实验都肯定了这些观点。将PTEN基因导入pten－的成胶质细胞瘤细胞²¹，前列腺细胞²²，黑素瘤细胞²³和乳腺癌细胞²⁴中组成型表达可抑制肿瘤细胞的生长，而且在软琼脂上的生长能力大大降低，并且丧失了在裸鼠体内的成瘤性25。有趣的是，PTEN在不同种类的细胞中似乎是通过不同的机制来抑制细胞生长，在成胶质细胞瘤细胞中，产生G1-arrest，而在其它肿瘤细胞中则是诱导细胞凋亡。

    用基因敲除技术可研究PTEN在小鼠发育中的功能。pten-/-突变体表现为胚胎早期致死。通过对在植入后不同时间点对胚胎的检查表明，致死是发生在植入后，妊娠前²⁶，说明PTEN对胚胎的发育是必需的。pten+/-突变体表现为对肿瘤易感。在小鼠的发育中伴随有结肠癌，睾丸肿瘤，甲状腺肿瘤，急性髓细胞白血病等发生²⁷。以上这些实验都证明PTEN具有肿瘤抑制功能，是一个新发现的抑癌基因。

PTEN基因产物是一个双重特异性磷酸酶
    PTEN的cDNA序列强烈表明它是蛋白质酪氨酸磷酸酶基因（PTPase）超家族的成员，PTPase的典型结构为一个保守的催化结构域及两旁的非催化序列及调控区。PTPase超家族可以进一步分为“经典”PTP和双重特异性磷酸酶家族（dual
-specificity phosphotase, DSPase），前者可在体内和体外高度选择性的作用于磷酸酪氨酸残基，而后者DSPase，即可以在酪氨酸和丝/苏氨酸残基去除磷酸集团。PTEN在其C末端有一个包含PDZ结构域蛋白的结合位点。PDZ蛋白已表明是在细胞膜，细胞骨架上多蛋白复合体的组建中起作用，而且PTEN与细胞骨架蛋白中的张力蛋白和辅助蛋白同源，说明PTEN可能参与调控细胞骨架相关蛋白的磷酸化事件。

    尽管PTEN与双重特异性磷酸酶具有很高的同源性，重组表达制备的PTEN蛋白在体外对于通常的底物很难检测到强的催化活性。而且虽然PTEN可对某些丝/苏氨酸磷酸化蛋白去磷酸基，但是在对poly(Gly-pTyr)底物表现出最大的催化活性，说明PTEN蛋白偏爱酸性底物²⁸。尽管如此，PTEN表现出的催化活性仍没有其它DSPase强，表明PTEN的反应底物可能不是蛋白质。事实上，磷脂酰肌醇三磷酸（phosphatidylinositol-3,4,5-triphosphate, PIP3）已被证明是PTEN的主要作用底物，PTEN可在体内和体外特异性地切割PIP3这个第二信使的D3位磷酸基，与PI3激酶（PI3-kinase）的活性相对应²⁹。PTEN蛋白的晶体结构（见图二）对于说明这个没有料想到的催化潜力是最好的说明。PTEN不象其它的DSPase，包围在其催化中心的一个Loop环有四个残基的插入，使得形成一个较为宽广的口袋，可容纳PIP330。晶体结构的数据同时也揭开了PTEN结构的又一个特性：催化中心为3个带正电的氨基酸（Lys-125, Lys-128, His-93）包围，这也是为什么PTEN对高度酸性底物偏爱的原因。PTEN的催化口袋很深且宽，足以容纳磷酸酪氨酸或磷酸丝/苏氨酸残基，所以PTEN也可以作用于蛋白质。但是对几个独立的病人来源的PTEN突变体分析表明，在肿瘤病人中的突变体PTEN蛋白保留有蛋白磷酸酶的活性，但是丧失了对PIP3去磷酸基的活性²²。这说明PTEN的肿瘤抑制功能的发挥是主要依靠它的脂类磷酸酶活性进行细胞凋亡和周期的调控。

    Tamura的工作显示PTEN可高度选择性的对磷酸酪氨酸残基作为靶位点31。他发现，过量表达PTEN可抑制而PTEN的反义寡核苷酸可刺激成纤维细胞的迁移，他同时报道聚焦粘附激酶（focal adhesin kinase，FAK）和Shc可被PTEN调控，说明PTEN通过控制FAK活性调控聚焦粘附，细胞伸展和迁移等。这样又把PTEN连入FAK相关的整合素信号传导通路中。

 A.

B. C.


Fig2. Model of PTEN and PIP3 binding to the PTEN active site
A. Overall view of the PTEN structure. The dotted line indicate the region deleted in the crystallized protein. 
B. The phosphate groups at the D3 and D4 positions of PIP3 are uperimposed on the carboxylate groups of the tartrate molecule bound in the PTEN active site.
C. Model of PTEN-PIP3 complex. Side chains that are important for PIP3 binding are shown.
From Cell 99: 323-334, 1999

PTEN对细胞凋亡和细胞周期的控制
    发现PIP3是PTEN的体内主要底物，立即把这个磷酸酶连入一个明晰的途径中。PIP3在静止细胞中水平很低，但是在生长因子的刺激下，通过活化PI3激酶，PIP3水平迅速提高。PIP3在膜上聚焦，活化那些可以结合PIP3，并含有pleckstrin homology(PH)结构域的蛋白质，主要有两个蛋白质丝/苏氨酸激酶AKT和PDK1。

    AKT是作为病毒编码的可以恶性转化淋巴细胞的癌基因产物而被克隆发现的。其蛋白产物有一个与PKA，PKC家族蛋白激酶高度同源的催化结构域，故也称为PKB。AKT通过磷酸化而被活化，活化的AKT是一个细胞存活因子，它可以响应NGF，IGF－1，PDGF，IL－3等细胞因子和细胞外基质等释放一个细胞存活信号，帮助细胞逃避程序化死亡，而细胞逃避自身防御性死亡正是肿瘤发生的关键环节³²。活化的AKT通过磷酸化多个靶蛋白使它们失活传递存活信号，抑制细胞色素C从线粒体中释放并失活转录因子FKHR，而FKHR是诱导凋亡相关基因表达所必需的。被失活的靶蛋白有Bcl-2家族成员BAD和caspase-9，尽管caspase-9仅在人类细胞中作为AKT的底物33。
越来越多的实验都证明PTEN与AKT/PI3K通路的联系，进而与肿瘤相关。首先，在正常细胞中，AKT活性在缺少生长因子刺激的情况下是极低的，然而PTEN缺失的肿瘤细胞，永生性成纤维细胞及来源于PTEN缺失小鼠的肿瘤中，AKT磷酸化水平都很高³⁴；第二，与AKT抗凋亡作用相一致的，PTEN-/-成纤维细胞可抵抗多种诱导凋亡的刺激物，而组成型地表达PTEN可恢复正常AKT调节和细胞对这些诱导物的敏感³⁵；最后，在PTEN共转活化的PI3K或AKT可以有效的拮抗PTEN介导的生长抑制作用。这些结果说明，PTEN在体内可调节PI3K/AKT信号传导通路，对PI3K/AKT通路的调控能力的丧失可能对大多肿瘤的发生、发展起作用。

    总之，在这个上下反应的通路中，PTEN的作用就是保持PIP3处于低水平。PTEN功能的丧失将导致PIP3浓度的增加，进而AKT超活化，使细胞逃避各种凋亡刺激作用³⁵。令人惊讶的是，甚至仅失活PTEN的一个基因座，对某些细胞，如淋巴细胞的增殖和存活都有剧烈的影响。pten+/-突变体发育为致死性的自身免疫性综合症，具有的特征与Fas缺失突变体相似。另外，pten-/-小鼠和细胞丧失依赖于Fas的凋亡效应，而这一损伤可以由PI3K抑制剂所弥补³⁶，说明在Fas依赖性凋亡过程和PI3K/AKT抗凋亡效应之间由PTEN建立起遗传联系。

    在神经胶质瘤（glioma）和乳腺癌细胞中过量表达PTEN导致AKT失活并诱导anoikis（一种由细胞从细胞外基质脱落而启动的特定凋亡途径），这个效应也可以通过抑制PI3K活性来模拟^37，38。这样，PTEN通过抑制依赖于PI3K的存活信号而与细胞外基质丧失联系，进而控制细胞死亡。
在多种肿瘤细胞中过量表达PTEN可以进一步了解其在细胞周期调控和肿瘤抑制中的作用。在缺少外界刺激，并存在生长因子的条件下，在一些pten-/-的细胞中，如成胶质细胞瘤、乳腺癌、肾癌细胞中恢复PTEN的表达，在转染24小时后出现G1-arrest³⁶。这个G1－arrest效应与转录后p27蛋白的表达水平上调并与cyclin E/CDK2复合体结合以及抑制Rb磷酸化等过程相关联，这一结果也与p27蛋白表达水平在pten-/-的ES细胞中下调的事实相吻合³⁹。由于PI3K抑制剂可模拟PTEN在细胞周期及p27蛋白水平调控中的作用，PTEN对p27的调控似乎也是依赖于抑制PI3K/AKT通路。PTEN与Rb转录关联可由实验PTEN在Rb-/-的saos-2或C33A细胞中不能诱导G1-arrest，除非Rb与PTEN共转染这两种细胞得到证明⁴⁰。然而，在一些pten-/-的癌细胞中，如成胶质细胞瘤细胞系LN229中过量表达PTEN并不导致G1-arrest。

    为什么重新导入PTEN到不同的肿瘤细胞引起或者细胞周期停滞（成胶质细胞瘤细胞，肾癌细胞），或者细胞凋亡（前列腺癌细胞），表明再次表达PTEN所表现的肿瘤抑制作用依赖于肿瘤来源的细胞类型。PTEN的行为同样被其它一些在肿瘤转移过程中失去控制额癌基因途径所影响。最近的一些实验结果表明，过量表达PTEN的效果在不同的时间点分析或在不同的培养条件下都有改变⁴¹。例如在乳腺埃细胞中恢复PTEN活性，先导致G1-arrest，接着是细胞凋亡。在前列腺细胞中，PTEN表达出现凋亡，细胞的死亡是仅在携带有PTEN的腺病毒感染细胞4天后才出现⁴²，而且在无血清情况下，细胞已经处于G1-arrest状态，PTEN可随时诱导乳腺癌细胞的凋亡³⁶。

    这些发现可以在一个模型中得到统一，在缺少外界凋亡刺激下（如cell detachment, Fas, etc.)，PTEN通过诱导G1-arrest来执行其抑癌功能。在这一模型中，凋亡是发生在PTEN诱导G1-arrest之后，并作为由PTEN介导的抑制生长因子依赖的存活信号的释放的结果。PTEN诱导的细胞程序化死亡的程度及动力学依赖于营养支持的水平。（待续）