干细胞研究与治疗性克隆（中）

奇 云
（安徽省淮南职业医专副教授，淮南市 232001）

（续前）
五. 造血干细胞与基因治疗
    基因治疗的临床研究始于1991年，至今虽已取得很大进展，但一些重大难题尚未解决。例如：基因转染的载体、目的基因体内转染的靶向性、目的基因在体内表达的水平和时间的调控，以及有治疗效果基因的选择和寻找等。为了使目的基因能在病人体内长期或永久地表达，必须选一种能在体内自我更新和自我维持的永不消亡的细胞，来作为目的基因的宿主细胞。于是，造血干细胞便成为最理想的目的基因转染的靶细胞了。7年前，研究者已成功地把目的基因转染整合到小鼠骨髓干细胞的染色体基因组中，使目的基因在小鼠体内持续表达。这时，人们以为基因转染人的造血干细胞也同样容易实现，美国各大药厂纷纷大量投资做基因治疗的临床前研究和临床试验。由于当时基因治疗的基础研究还很差，人们对造血干细胞生物学和分子病毒学及载体构建技术的知识了解不足，临床试验几乎都告失败。

    从1995年起，研究者总结经验教训，重新回到基础研究领域，对造血干细胞生物学，病毒载体的筛选、重组及其转染技术等进行了广泛而又深入的研究。随着研究的不断深入，基因治疗的临床应用前景又重新出现希望和乐观。用造血干细胞做基因转染，首先遇到的困难是基因转染率太低。于是许多人热衷于体外扩增干细胞，但至今未见有成功的报告，其原因有三：①干细胞的基本特征是自我维持和自我更新，即干细胞通过它不对称性的有丝分裂，在不断产生祖细胞的同时，使自己不增殖也不分化。所以，正常干细胞的特征便是在体内外保持自己数量不变，质量也不变的条件下不断地生成大量祖细胞。近年来，经动员的外周血干细胞的富集技术日趋完善。动员的外周血CD34+细胞移植物中含足够数量的干细胞(>108)，做细胞基因转染就不需要先体外扩增了。而且，用G-CSF动员的外周血CD34+CD38-细胞很多从G0期转移到G1期。这也有利于提高逆转录病毒载体与目的基因整合到干细胞的基因组中，因为仅仅在有丝分裂的阶段，逆转录病毒载体的逆转录DNA才能整合到染色体的基因组中去。当基因治疗某些疾病时，要求目的基因能在体内永恒表达发挥治疗作用的疾病，例如糖尿病、高血压病、帕金森病、先天性单基因缺损的各种疾患等，其目的基因的理想宿主细胞自然是永不消亡的造血干细胞。但如果不是为了弥补基因缺陷，而是为了在一个短时间内达到某一个治疗的目的，仅要求目的基因在病人体内短期表达。例如为了实现对肿瘤的超大剂量化疗时保护造血细胞用的多药物耐药基因的转染，则目的基因MDR-1转染的宿主细胞不应该是干细胞，而是早期祖细胞。

    为什么成功地用于小鼠造血干细胞的基因转染技术，却不适用于人呢，人们发现，逆转录病毒颗粒进入靶细胞之前，首先必须是病毒颗粒的包膜(envelope)糖蛋白gp70和靶细胞表面某种蛋白发生专一性的结合。靶细胞表面的专一性结合某种病毒的蛋白，称为病毒受体。用于小鼠的亲嗜性逆转录病毒载体(ecotropic retroviral ector)只能用于小鼠而不能用于人。小鼠造血干细胞表面有较丰富的亲嗜性逆转录病毒受体，而人的造血干细胞表面没有亲嗜性逆转录病毒受体，仅有少量的兼嗜性逆转录病毒受体(amphotropic retroviral receptor,即PiT-2受体)。所以，适用于人造血干细胞做基因转染的，是重组的兼嗜性逆转录病毒载体(amphotropic retroviral vector)。于是，科学家们近年来致力于如何增加人干细胞表达专一性的PiT-2受体，以增加基因的转染率。

    美国国立卫生研究院(NIH)国家人类基因组研究中心的研究者，用豆蔻酰佛波醇乙酯(phorbol myristate acetate, PMA) 32 μmol/L或IL-1α 10ng/ml加入培养24-48小时，可以使人的CD34+/CD38-/Lin-细胞表面的PiT-2受体明显地增加，从而提高了兼嗜性逆转录病毒载体的基因转染率。他们还发现，HL-60细胞原本缺乏PiT-2受体，所以是抗兼嗜性逆转录病毒转染的。但他们用PMA使HL-60细胞表面的PiT-2受体增加，就能使逆转录病毒载体基因转染到HL-60细胞中，而且转染率很高。其基因转染率和HL-60细胞的PiT-2 mRNA水平呈正相关，却和HL-60细胞处于什么细胞周期状态无关。

    美国NIH的实验室又报告，干细胞经低温冷冻后，可以增加细胞表面的PiT-2受体数量。还有许多实验室探索如何提高人造血干细胞的基因转染率。例如在体外培养中，把人CD34+细胞平铺在贴壁的骨髓基质细胞上，再加入纤连蛋白(fibronectin)和病毒上清，即可有效地提高其基因转染率。干细胞移植成功究竟至少需要多少干细胞植入骨髓？有的学者从理论上估计，有几千或甚至几百个干细胞植入骨髓就够了。这是否意味着，造血干细胞的基因转染率不一定需要很高，如果设法把带有目的基因的CD34+细胞直接输入骨髓腔，即使细胞的基因转染率低，也照样可以达到基因治疗的目的。对此，临床造血干细胞移植也可以进行探索。本世纪，人类基因组研究和造血干细胞生物学的发展，将可能找出干细胞调控分化的基因，干细胞分化调控机制及自我维持和自我更新的调控机制得到充分阐明。到那时，白血病细胞分化受阻的机制也得到答案，其根治办法也可能是基因治疗。人类造血干细胞基因治疗实际上是基因治疗技术和造血干细胞移植技术的融合和发展，也是学科交叉的产物。它不但促进干/祖细胞生物学的发展，使基因治疗开辟了新的领域，而且将扩大造血干细胞移植的适应证范围，将使整个血液学发展到一个新的纪元。尽管目前对于干细胞基因治疗的理论和实践均有待进一步深入研究，但可以预见，一旦干细胞治疗技术获得突破，将对人类疾病的体细胞基因治疗产生极为深远的影响。

六. 骨髓间质干细胞的潜在应用
    最近的许多研究发现，在人类、鸟类、啮齿类等生物的骨髓中，可分离出一种骨髓间质干细胞（Mesenchymalstem cells, MSC）。MSC具有干细胞的共性，即自我更新及多向分化的能力。一般认为MSC只存在于骨髓中，但最近的研究发现从人的骨骼肌中也分离出了MSC，它同样可以分化为骨骼肌管、平滑肌、骨、软骨及脂肪。此外，也有人分别从骨外膜和骨小梁分离出MSC。同造血干细胞相似，由于目前尚无MSC的特异性标志，对MSC的特征描述及其分离方法都是以一个细胞群体的形式进行的。由于它具有向骨、软骨、脂肪、肌肉及肌腱等组织分化的潜能，因而利用它进行组织工程学研究有如下优势：（1）取材方便且对机体无害。间质干细胞可取自自体骨髓，简单的骨髓穿刺即可获得。（2）由于间质干细胞取自自体，由它诱导而来的组织在进行移植时不存在组织配型及免疫排斥问题。（3）由间质干细胞分化的组织类型广泛，理论上能分化为所有的间质组织类型：将它分化为骨、软骨或肌肉、肌腱，在治疗创伤性疾病中具有应用价值。将它分化为心肌组织，则有可能构建人工心脏。将它分化为真皮组织，则在烧伤中有不可限量的应用前景。地塞米松是MSC分化的非特异诱导剂，它可使MCS分化成骨及脂肪细胞，而两性霉素B则可使MSC分化为肌细胞，还有人利用大鼠的MSC进行了向肌肉分化的研究，发现5-Azacytidine和5-Aza-2'-Deoxycytidine均可促使MSC向肌肉的分化。有关肌细胞及肌腱的诱导分化的方法还不成熟，有待进一步的研究。MSC起源于中胚层，理论上讲，它应可以向其它中胚层组织分化如真皮、结缔组织及上皮等，尤其是真皮，如能诱导成功，则在烧伤的治疗中有不可低估的作用。

七. 神经干细胞（neurai stem cells）研究概况及其应用前景
    神经干细胞是中枢神经系统中保持分裂和分化潜能的细胞，对她的研究和应用已成为近年来脑科学研究的一个重要领域。它不仅改变了人为成年动物的神经细胞不能分裂的传统观点，而且在研究脑的发育和分化以及疾病治疗上均具有重大价值。神经干细胞体外培养技术的建立提供了对其进行研究的有力手段。目前的研究主要集中于神经干细胞在脑中的起源、分布及在治疗中的应用等方面。在发育和成熟的中枢神经系统中均存在着神经干细胞(neural stem cells，NSCs )。另外也有实验证实，胎鼠的小脑半球、海马、皮层脑室区等亦可分离出神经干细胞。近来研究者已从人胎儿大脑皮层中分离出中枢神经干细胞。同时使用表皮生长因子（EGF）、神经生长因子（EGF-2）等扩增出细胞群，并用低物诱导细胞可分化出神经元及星型细胞。脑内的神经干细胞是多能干细胞，它可以分化为脑内三种神经细胞。目前尚不清楚的是干细胞是否只能分化为它们定居点的细胞类型，是否具有向其它胚层细胞转化的能力。最新研究发现，小鼠神经干细胞被移植到经放射线照射的小鼠体内后，产生了各系血细胞。提示起源于外胚层的神经细胞可向中胚层细胞转化，同时也表明神经干细胞有更广泛的分化潜能和应用前景。

    尽管在体外可以分离和培养神经干细胞，但目前对神经干细胞的生物学特性知之甚少。一般认为神经干细胞不表达分化相关的标志如NSE、GAFP（胶质酸性蛋白）及Vimentin（波形纤维蛋白），表达成神经上皮细胞标志nestin、Notch1、Musashi、EGF受体及FGF受体，并可用相应的抗体常规地表达扩增的神经干细胞的特性。有研究者认为，室管膜区细胞发生不对称分裂，产生的两个子细胞，其中一个保持干细胞的全部特性并停留在室管膜区，另一个立即分化为早期祖细胞。至于神经干细胞其它的生物学特性将会随着其研究的不断深入而逐渐被发现。许多因素参与了神经干细胞增殖分化的调控。体外研究表明生长因子可以调节干细胞的增殖和分化。FGF2主要调节神经干细胞的增殖，FGF1与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖相互作用后调节神经干细胞的分化。星形胶质细胞分化的调节主要依赖于白血病抑制因子受体（LIFR）介导的信号传递通路。活化的LIFR通过JAK-STAT途径直接激活GFAP基因的表达。已有研究证实，STAT3能直接联结到GFAP基因启动子的保守位点并调节其表达。维持干细胞状态的信号（如Notch介导的信号传递通路）则相应地抑制神经元的分化。体外诱导干细胞分化的实验中加入Notch1的反义核苷酸后，FGF1可显著增加神经元的数量。推测在体内诱导神经干细胞的分化可能也需要抑制Notch信号途径并同时激活FGF1介导的信号通路。与传统观点比较，发现神经干细胞有更大的可塑性和分化潜能，由于对神经干细胞的研究才刚刚起步，尚有许多关键性问题尚未解决。

    因此，研究者认为未来对神经干细胞的研究将集中在以下几个方面：第一，进一步研究神经干细胞生物学特征以及分离、纯化和扩增的条件；第二，确定人类是否也具有神经干细胞；第三，人类神经干细胞在脑内的定位以及怎样在原位诱导神经干细胞增殖分化以补充因疾病和损伤所丢失的神经细胞；第四，人类神经干细胞是否也可向其它胚层的细胞转化等等。中枢神经系统疾病中有很多是因为某种特定的脑细胞发生退行性死亡，导致一些重要的神经递质、蛋白质因子或某些重要结构的匮乏所致。因次在成功地培养了神经干细胞之后，人们很自然的想到利用它直接进行移植治疗，或利用病毒载体，携带目的基因，导入神经干细胞，将筛选得到的体外高效表达目的基因的克隆进行移植。则中性的细胞治疗方法具有以下优点：（1）神经干细胞在脑中能根据其周围微环境的诱导而分裂，分化成为相应的细胞类型，其形态和功能与附近的宿主细胞非常类似。即使是将因转入原癌基因而永生化的神经干细胞植入脑后也未长出肿瘤。（2）中枢神经系统具备特殊的结构－－血脑屏障，这使的淋巴细胞很难进入，因此不同个体之间，甚至是不同物种之间的神经干细胞移植，都几乎没有排斥反应，大大提高了神经干细胞的来源。（3）神经干细胞可以在体外根据不同的需要导入相应的外源基因，成为一种光谱的细胞载体。目前很多研究组根据神经干细胞的这些特性，从不同角度加以应用，在神经系统疾病治疗上取得了很大进展。总之，神经干细胞是一种具有广泛应用前景的干细胞，随着其研究的不断深入，人类的神经干细胞将有望作为脑移植的供体细胞以及基因治疗的载体用于临床。而其增殖和定向诱导分化机制的最终阐明，将有赖于分子生物学、发育生物学等生物学科的相互协作和研究方法的进一步完善。

八. 胚胎干细胞研究的突破
    最值得一提的是胚胎干细胞（embryonic stem cells，ES)。胚胎干细胞是在胚胎发育早期——囊胚（受精后约5—7天）中未分化的细胞。囊胚含有约140个细胞，外表是一层扁平细胞，称“滋养层（trophoblast)”，可发育成胚胎的支持组织如胎盘等。中心的腔称“囊胚腔”，腔内一侧的细胞群，称“内细胞群(inner cell mass)”，这是一群具有全部分化能力的细胞，它们在胚胎发育的过程中，可以进一步分裂、分化，发育成个体。内细胞群在形成内、中、外三个胚层时开始分化。每个胚层将分别分化形成人体的各种组织和器官。如外胚层将分化为皮肤、眼睛和神经系统等，中胚层将形成骨骼、血液和肌肉等组织，内胚层将分化为肝、肺和肠等。由于内细胞群可以发育成完整的个体，因而这些细胞被认为具有全能性。当内细胞群在培养皿中培养时，我们称之为“胚胎干细胞”。通过研究发现，分离的小鼠胚胎干细胞在体外可以分化成各种细胞，包括神经细胞、造血干细胞和心肌细胞。令人惊奇的是，这些细胞还具有自行发育成某些原始结构的趋势。如在一定的培养条件下，一部分胚胎干细胞会分化为胚状体（与小的跳动的心脏具有奇异的相似之处），而另一些细胞会发育成包含造血干细胞的卵黄囊。形成胚状体和卵黄囊的比例可通过改变培养基而改变，但至今还没有诱导胚胎干细胞发育为一纯的分化细胞群的报道。

    从理论上讲，小鼠胚胎干细胞具有发育成某一器官的能力，但还没有用干细胞体外培养成器官的报道。不过，如果将小鼠胚胎干细胞移植到重度复合免疫缺损小鼠（SCID，它不会排斥移植的细胞）体内时，胚胎干细胞则能够发育成肌肉、软骨、骨骼、牙齿和毛发。但无论如何，如果直接将分离的小鼠胚胎干细胞植入子宫内，它们不会发育成个体小鼠，因为没有着床必需的滋养层细胞。这种条件下，胚胎干细胞被认为是多能的（pluripotent），而不是全能的（totipotent）。尽管如此，如果将胚胎干细胞植入不能发育成个体的四倍体胚胎中，再将该胚胎植入小鼠子宫中，那么可以获得完全是由培养的胚胎干细胞产生的正常个体小鼠。这表明了胚胎干细胞具有难以置信的全能性。

    研究和利用胚胎干细胞是当前生物工程领域的核心问题之一。目前许多研究工作都是以小鼠胚胎干细胞为研究对象展开的，如：德、美两国医学小组在去年成功的向实验鼠体内移植了由胚胎干细胞培养出的神经胶质细胞。此后，密苏里的研究人员通过鼠胚细胞移植技术，使瘫痪的猫恢复了部分肢体活动能力。1998年末，两个研究小组成功的培养出人类胚胎干细胞，保持了胚胎干细胞分化为各种体细胞的全能性。这样就使科学家利用人类胚胎干细胞治疗各种疾病成为可能。

    为医治某一个患者而制造一个胚胎代价过高，因此更为实用和可行的方案是建立稳定的永生化的胚胎干细胞细胞系。最近提出的研究策略主要有三个：（1）应用克隆技术，用人成熟细胞核置换人卵细胞的遗传物质，然后在体外将其培养至胚泡期，分离胚胎干细胞，用于研究和治疗。此时胚胎尚未开始分化，各系统也未开始发育，故不能称之为“人”，因此这一技术与“克隆人”有明显区别。这一策略具有很大的诱惑力，如将正常细胞核置入受体无核卵细胞中，培养和分离胚胎干细胞，在将其体外定向诱导分化为各种特定的功能细胞，用于治疗因这些细胞损伤而引起的多种严重疾病。例如分化为多巴胺神经元治疗帕金森病，分化为胰岛细胞治疗糖尿病，分化为肝细胞和肌细胞治疗肝纤维化和肌萎缩，甚至还可以分化为CD4+细胞治疗艾滋病。目前利用核移植技术获取胚胎干细胞已在羊和小鼠实验中得到验证，但距其应用于人类疾病的治疗还需较长时间。（2）将人类的细胞核置入到其它哺乳动物的无核卵细胞以获取胚胎干细胞。通过对牛、羊、鼠的研究已经证实，克隆的后代看起来都与提供起源细胞核的供核动物的后代相象，而不象供卵者的后代。因此，这一策略可以用来获取胚胎干细胞，并已开始在牛和鼠身上进行实验，如果可行，那么便可以避免应用人的卵细胞。目前异种核移植尚未得到令人鼓舞的结果。此外在伦理学上，这种通过其它动物的卵细胞获得的胚胎能否被称为人的胚胎也将成为一个新的课题。（3）将成人的细胞核植入胚胎干细胞的胞浆内，通过胚胎干细胞的胞浆与供体细胞核的作用，诱导表达胚胎干细胞特异性的基因已有研究发现，将成纤维细胞核植入肝细胞的胞浆中，结果可以表达一个肝细胞特异性的基因。但这一技术目前还不成熟。

    据国际文传电讯社报道，哈萨克斯坦的阿克久宾斯克医学院科学家从人工流产的一个半月大的胎儿体中取出干细胞，并将其植入实验鼠肝脏内。在植入前，实验鼠的肝脏已被人为诱发病变。植入干细胞后，干细胞在实验鼠体内渐渐成长为健康肝细胞。７个月后，病鼠肝脏恢复正常功能。报道说，哈科学家不久将利用植入人体胚胎干细胞方法，对肝功能不全或肝硬化的患者进行临床试实验。研究者认为，假若在年老时能用上自己或他人婴幼儿或青年时期采集保存的干细胞及其衍生组织，那么人类长期追求的长生不老的幻想就有可能变为现实。

    传统的器官移植手段，因其昂贵的价格，成了富人的专利，对于穷人来说，无疑是一种神话。而人体胚胎干细胞的研究成果，将逐步打破这个神话，不仅使得器官移植将像打针吃药一样平常起来，而且使得器官移植更加安全可靠。随着干细胞的深入研究，像癌症和心脏病这样令人恐怖的疾病，也将会变得不堪一击了。对患有糖尿病、进行性老年性痴呆、严重的心力衰竭或其他疾病的患者来说，如果从他身上任何部位取下一些体细胞，通过核移植技术，将其体细胞的细胞核显微注射至去核的人卵细胞中，这种包含与病人完全相同的遗传物质的杂合卵细胞在体外培养发育成囊胚，若将囊胚植入假孕妇女的子宫中，将会克隆出与提供体细胞的人基因相同的个体，即所谓的“克隆人”。但是如果从获得的囊胚中分离并扩增人胚胎干细胞，并体外诱导它们分化成胰岛细胞、神经元、心肌细胞等，将这些细胞移植至发病部位，则能够修复病人的组织或器官，从而使病人免受病魔的煎熬。由于移植细胞与病人的基因完全相同，不会产生通常器官移植中的免疫排斥反应，修复的组织或器官将良好地履行职责，无需使用免疫抑制剂。也许你会认为这是科幻小说，但这种情景也许在不远的将来（有可能是几年之内）会成为一种常规的治疗方法。

    1998年11月，威斯康星大学的汤姆生教授和约翰.霍普金斯大学的吉尔哈特教授分别在《科学》和《美国科学院论文集》上报道，他们用不同的方法获得了具有无限增殖和全能分化潜力的人胚胎干细胞。这一成就将会给移植治疗、药物发现及筛选、细胞及基因治疗和生物发育的基础研究等带来深远的影响，打开在体外生产所有类型的可供移植治疗的人体细胞、组织乃至器官的大门。在我国，人类胚胎干细胞的研究也有了可喜的进展。最近，重庆妇幼保健院生殖与遗传研究所完成了中国首例囊胚期胚胎培养技术。该技术不仅大大提高了试管婴儿的妊娠成功率，还有效地降低多胞胎发生率。美国哈佛大学医学院正与重庆市妇幼保健院生殖与遗传研究所合作，共同研究胚胎干细胞的分化，这将为克隆人体器官创造条件。（待续）