生物钟运行的分子机制（上）

卓铭

摘要

    生物钟是存在于非常广泛的生物里的节律性生理现象，在小至单个的细胞就已经具有了完整的生物钟的结构和功能，表明生物钟的运作实际是在分子水平进行,其基本的工作原理主要依赖于对核心的时钟元件的基因转录的调控。生物钟在进化上的起源非常古老，其结构和功能也随着进化而不断发展，因此不同的物种在生物钟的结构上既具有相似乃至共同的部分，也存在各自的特殊结构。本文综述了生物钟在分子水平的基本结构和运行方式，以及在基因水平的基本结构，并详细阐述了几种在进化上具有典型性的生物的生物钟结构系统，包括存在于Synechococcus的以kai为核心时钟元件的生物钟系统，存在于链胞霉的frq系统，存在于果蝇的per/tim系统和存在于小鼠的per/per系统。
关键词：生物钟，时钟元件，转录调控，kai, frq, per.

    生物钟是一种奇妙的生理机能，"春眠不觉晓"，是人们对它最初的，也是最直接的认识，而跨国旅行时时差的改变给人们带来的影响就强烈得多，以致于许多人要好几天才能适应。虽然疲倦，瞌睡长期以来都被认为只是个人的主观感受，但是无疑生物钟是实实在在可以直接影响到我们的感受。藏在我们体内的这个小小时钟，它究竟是怎样运行的，又是如何来影响人们的行为乃至生活的呢?对于这个问题的研究在很久以前就开始了，但最初的研究，受研究手段的限制，许多结论都比较片面，直到分子生物学技术上日臻成熟，这方面的研究才取得突破性进展。

图1从进化的角度看生物钟的出现(大写的物种具有生物钟结构)

    曾经有很长时间，生物钟都被认为是只有高等生物才具有的生理现象，它的作用也被认为是在神经生理学范畴之内，因而在生物钟研究的初期，主要的研究都是在神经生理学方面，这个时期确定了SCN是哺乳动物的核心时钟中枢，由它来统一全身的时间状态。虽然发现于SCN神经细胞的自主时钟现象提示了具有最小时钟的单位可能就是单个细胞，但直到存在于真菌中的生物钟被发现以后，才确定了生物钟现象并不一定需要脑的参与，而发现于蓝细菌的生物钟则最终确定了生物钟的的确确是可以仅在单个细胞内就完成的生物节律现象。现在已经发现的具有生物钟现象的生物非常广泛，包括所有的动，植物的绝大多数的真核生物以及象蓝细菌这样的原核生物都具有自己的生物钟。从进化的角度看，能够出现于如蓝细菌这么古老的生物中，生物钟现象可以说是重要的基本生命机能。

细胞中时钟的基本结构
    在蓝细菌中发现存在生物钟表明生物钟的最基本的层次是发生于单个细胞内的时钟现象，而现在对于即使复杂如SCN的系统的研究也确定了时钟的产生最终来自单个的细胞[1]。实际上，在正式的研究开始以前，我们就能通过逻辑推理来指导研究的方向。在生物钟的研究上首先可以确定的结构研究上的3个要点，也就是所要研究的3个核心问题是: 1生物钟的在分子水平的运作方式，也就是具体的驱动细胞节律化生理现象的分子生物学的途径及与之相应的遗传学，即基因水平的基础。2 细胞的生物钟是如何被重置的，即细胞内的节律现象是如何响应外界环境的变化并逐步调整而与环境同步的。3发生于单个细胞内的生物钟，其结果是如何输出的，这包括生物钟是如何影响该细胞的行为以及如何进一步影响周围细胞乃至组织以至机体的行为。

    类比于现实生活中的一个闹钟，将以上要素套用到闹钟上,然后将答案加以类比，我们可以很容易的构想出生物钟的基本结构: 比如在钟是如何运行的问题上，如同现实的钟是通过钟摆的来回摆动来引导时钟运行一样，生物钟也需要通过一个核心元件的循环变化来引导时钟的运行。在运行的过程中，驱动元件负责将钟摆，也就是核心元件摆动起来，而负反馈元件则负责在钟摆到达最高点后让它摆回去。而在如何调节时钟的时间上，最为简明而直接的方法就是将指针直接拨到正确的时间上去。事实上，对于许多生物的生物钟的研究发现，它们的确是具有上述的结构，并也是如上发挥作用的。其通用的结构可以用下图加以说明。

图2：生物钟的通用基本结构。

    这些元件的工作方式，由于它们的作用也是在分子生物学范畴之内，通过类比于普通的分子生物学信号途径，可以预计它们主要是通过转录/表达的调控而发挥作用。另外可以想见的是，处于进化树不同地位的生物，其自身结构上的巨大差别会导致它们在如何构成自己的生物钟方面必然是各有一套的，所以这里将从低级向高级来阐述一些具有典型性的生物它们的生物钟结构。


一 蓝细菌(Synechococcus)的生物钟结构
    存在于单细胞的蓝细菌中的生物钟无疑是各种生物钟里结构最简单的，因为它们至少在时钟的输出问题上几乎完全不用下功夫，所以它们的生物钟的模型可以展示生物钟在运行中所需最小化的的全部要素。 Synechococcus的生物钟系统是最早被阐明的蓝细菌的生物钟系统。Synechococcus的生物钟影响着它的生活的许多方面，比如细胞分裂，氨基酸摄取，固氮作用，光合作用和呼吸等。对于单细胞体的蓝细菌而言，由于固氮酶会被光合作用所产生的氧分子所失活，通过准确的时钟系统而使固氮作用只发生在光合作用所产生的残留氧分子消失之后对它们的生存非常重要。当存在生存竞争时，具有和环境时钟相似节律的Synechococcus可以确立它们的竞争优势[2]。Synechococcus的生物钟模型是通过对Synechococcus的生物钟缺陷型的鉴定[3]和分析[4]而确立的，这个系统是是通过典型的基因调控机制而运作的。由于确定Synechococcus的光合作用是受其生物钟所调控的，Synechococcus的光合作用系统II基因被融合了荧光蛋白报告基因以便利于对时钟现象的研究[4]。 以这个融合蛋白的发光为标记，时钟突变体可以很容易的筛选出来。通过对具有从14-60hr节律的五十多个突变株的基因上的差异进行筛选，获得了造成时钟突变的基因。这个命名为kai的基因实际上是一个基因蔟。 kai的表达由2个启动子控制，一个负责kai A的表达，另一个负责kai B 和kai C。事实上，所有的生物钟突变体的时钟节律都可以通过转入野生型Synechococcus的kai基因簇而恢复正常，这表明kai基因就是控制Synechococcus的生物钟的核心基因。通过改变各种kai的结构和表达量以及kai对于Synechococcus的光合作用的研究，发现kai A与kai B,C对于时钟节律的影响是通过不同的方式实现的[3]。在Synechococcus中，正常时kai A的RNA水平在细胞自主时间(Circadian Time, CT)9-12小时时达到顶峰。对kai A进行突变使之失活的话，会使kai B,C的表达失去时钟节律性，而过表达kai A会使kai B,C亦过量表达，而这种过量表达是持续的，丧失了时钟节律性。kai B，C的表达在CT12时出现非常尖锐的高峰，对于其中任何一个进行突变，都会使它们无节律的过量表达。单独过表达kai c也能够导致时钟节律的丧失，不过它的作用是抑制kai b，c的表达[4]。kai B的作用目前还没有明确。

                     表达量

(细胞时间)

图3 Synechococcus时钟元件的变化周期

    以这些结果为依据，可以构建出Synechococcus的生物钟的基本运行方式: 在自我时间开始的时候，kai A作为激活元件，促使所有的kai的表达上升。kai C作为负反馈元件，在早期浓度较低的情况下作用并不能拮抗kai A的激活作用，于是钟摆开始摆动并逐渐摆向顶峰。经过一段时间表达不断上升的过程后，具有较高表达量的kai C终于达到足够的浓度足以拮抗kai A的作用，于是时钟蛋白的表达开始被抑制，从而让钟摆摆回起点(参见图4)。

图4 Synechococcus的时钟结构示意图

    下面的问题是，KAI蛋白是怎样发挥作用的呢?非常令人吃惊的是，对kai基因蔟进行的序列分析中，并没有发现在kai A，B中存在任何功能性结构花式的序列，在KaiC的序列中虽然发现了可以与ATP/GTP结合的结构的序列，但却只是在序列上的存在,所有的实体KAI蛋白都不具有结合核酸的域。然而，KAI蛋白却实实在在的能够改变靶分子的RNA浓度,对此目前只能估计是由于KAI蛋白可以通过直接影响聚合酶本身的活性，或影响聚合酶的某个重要的调节因子来发挥作用。由于在聚合酶这样重要蛋白的基因上的突变将使细胞无法生存，因而相应的突变体无法筛选得到。根据这种推测，而事实上也的确如此的是， KAI在Synechococcus中的作用非常广泛，以至于可以说整个Synechococcus的基因组都受到KAI的调控[5]。几乎所有的基因的表达都和KAI要么同相，要么以不同波形或反相而节律行变化。有趣的是，当在Synechococcus中转入来自其他生物的原本在表达上没有节律性的基因的启动子，比如来自大肠杆菌的启动子时，这些启动子所驱动的基因的表达也出现了节律现象[4]。

    在蓝细菌的培养过程中发现，蓝细菌的生物钟节律会逐渐同步于温度和明暗循环[2]，由于发现了蓝细菌可以向光性扩散，表明蓝细菌可能具有光感受体[6]。然而，目前没有任何数据表明KAI蛋白的表达会直接被光照度的变化所影响，当环境亮度发生变化时也没有直接观察到时钟基因表达上的波动现象，所以环境对蓝细菌生物钟的影响的模型目前也根本无法建立，相关的研究正在进行中。