生物钟运行的分子机制（中）

二 链胞霉(Neurospora)的生物钟系统
    链胞霉的发育存在节律性现象早在40年前就被发现[7]，虽然当时并没有认识到这是在受生物钟调控的生理现象。由于细胞分化的出现，对应于链胞霉不同部位的细胞，其生物钟也具有区域性的差别响应。培养于液态培养基的链胞霉和固态培养基上的链胞霉相比，虽然最显著的时钟节律现象是一致的，但是时钟的具体运行过程和周期是有所不同；培养于固体基质上的链胞霉，其基质的细胞和菌丝体受到的时钟的作用也是有区别的。链胞霉中最显著的时钟现象是，发育孢子的天线菌丝只由清晨生长出的菌丝体发育而成，而其他时候生长出的菌丝体则不会如此发育。对链胞霉的生物钟的研究也以天线菌丝为主要对象。

    最早从链胞霉的节律突变体中确定出节律相关基因实际上是早在七十年代的事情[8]，现在已经发现的链胞霉的节律突变体有三十多种，而发现的时钟基因有14个。frq是最早被克隆的链胞霉的时钟基因， 它编码链胞霉时钟循环的最核心的成分，其功能也已经基本明了[9],[10]。 frq可以编码2个FRQ蛋白，其中，长的为989残基的IFRQ，短的为890残基的sFRQ，sFRQ是以IFRQ内部的一个ATG为起始表达而形成的[11],[12]。 一个正常的时钟循环的建立需要这两种蛋白的同时存在。 在链胞霉中，frq的表达水平决定了时钟的进展程度，当frq的表达水平发生突然变化时，它的时钟将会被重置。通过对frq 的表达水平，FRQ蛋白的量的循环过程，以及FAQ如何反馈作用于frq以降低frq的表达的过程的研究，其他的时钟相关的基因陆续被发现，而链胞霉的生物钟模型也逐步成型。

图5 链胞酶时钟元件的变化周期

    正常情况下，在链胞霉的自主时钟的起点，frq的表达水平与FRQ的量均很低，但frq的表达量正在开始提高。 frq表达的活化是由另一个时钟成分，非同源二聚体蛋白WC1，2引发的[13]。 WC1，2都是具有PAS聚合域的蛋白，它们在体外可以提供该结构形成同源或异源的二聚体[14],[15]。但是，同源二聚体在链胞霉中没有明显的功能。WC1，2基因的表达在整个时钟过程中都在进行，其蛋白浓度在时钟过程中也只有些微的波动，在时钟运行的调控过程中，它们虽然是重要参与成分，但只是被动地发挥作用，引导调控过程的核心是FRQ蛋白。在体外的实验表明FRQ能够与WC2结合并阻断它的功能[16]。随着frq的不断转录，在黎明时，FRQ蛋白的浓度开始上升。FRQ在形成后很快就被磷酸化，并很快进入核内[17]，由于FRQ对WC2的抑制使得frq的表达很快就失去动力而下降，其表达水平呈现出尖锐的峰。由于转录到翻译之间的延迟，在frq表达开始下降时，FRQ的量仍在上升。当frq顶峰出现4小时之后FRQ到达顶峰。12点时，FRQ在核内的水平开始下降，但从整体细胞水平来看则还在上升中，直到下午才开始下降。同样在frq的表达跌入谷底后4小时，FRQ的量跌到谷底，失去抑制剂的WC1，2重新激活frq而开始新一轮时钟循环。整个周期是22hr。由此可以构建的链胞霉的生物钟的结构见下图。

图6 链胞霉生物钟的结构

    与蓝细菌明显不同的是，链胞霉的生物钟已经发现是可以被环境的变化所直接影响的。首先是，光照度的变化可以影响链胞霉的生物钟。由于在自然的昼夜循环中，对某一光强而言，会同时存在与之对应的一个上午的时间点和一个下午的时间点，对于链胞霉而言，这两个时间点是要予以区分的。这样，就有光是如何作用的，又是如何被区分的两个问题存在。在链胞霉中，特定时间点frq的表达水平和FRQ的量都是确定的，当frq的量被改变时，将会强制改变生物钟的时间点，而光的影响正是以这种强制作用来影响链胞霉的生物钟的。光照度的改变能够增强WC1/2的作用，从而提高frq的表达水平而改变时钟的状态，这个过程中只有WC-1是必须的[16]。在FRQ的量还不多的清晨，光的这种作用可以迅速的发挥出来。而在下午，在大量的FRQ将WC1，2的功能抑制住的时候，光的作用就被大大减弱了。这样的机制同时保证了清晨的光对时钟的校正功能和对清晨的光的判定。另外一个可以影响链胞霉的生物钟的重要的授时因子是温度。事实上，体温不能恒定的生物，其生物钟的运作和调节活动本身就直接为环境温度所限制，当然，这种被称为温度补偿效应的作用在各种生物中都是涉及很复杂的热力学和分子生物学的问题[18],[19]。然而，这种作用无疑不会是温度对生物钟的作用中的最主要的作用。链胞霉是一种可以由温度重置生物钟的生物[20]。不同于光以转录调控来影响时钟，温度对链胞霉的作用很大程度上是由翻译调控实现的。如前所述，具有一个内部翻译起始点的frq可以翻译出长短2种FRQ，低温下，是sFRQ更趋向于形成，而在高温下则趋向形成lFRQ。虽然在特定温度下，单独的任一FRQ都可以完成时钟的循环，但其时钟的运行周期并不相同。因而，确立正常的时钟循环周期需要合适比例的这2种蛋白，温度通过改变他们的比例而调节时钟的运行，当将某一个起始点删除后，温度的调节作用就消失了[21]。

    链胞霉也是最早出现ccg(时钟控制基因)的生物，ccg是指那些表达受到时钟循环的控制的非时钟核心成分的基因， 即时钟的靶基因。ccg中不包括参与时钟运行的基因，即对ccg进行突变不会影响时钟的运行[22]。在链胞霉中已经发现了有十多种ccg基因，它们参与了链胞霉的许多重要的细胞过程[23]。其中，ccg-4，ccg-6可以影响细胞的分化*22-1，ccg-7是糖酵解过程中的重要磷脂酶[24]。 由于细胞的分化而出现的不同的细胞在ccg基因表达上的差别决定了它们所受的生物钟的影响的不同。在链胞霉中由于并不存在时钟中枢，所以并没有将时钟的结果传达到其它细胞的输出系统。

三 果蝇的生物钟系统
    早在前分子水平，通过对果蝇的生物钟的研究已经确立了以后研究生物钟的基本方式。per是最早被克隆的果蝇的生物钟基因，也是对于生物钟的基因研究的起始基因。通过对它的研究开始了对整个生物钟体系的研究，与之相关的研究现在还在进行中[25]。同时，果蝇已经有了完整的组织和器官的分化，在果蝇的生物钟研究中，探索在分化了的细胞中生物钟是如何运作，和生物钟的运行如何输出并影响到其它细胞成为重要内容。通过组织的移植和镶嵌实验，确定了在果蝇中，无论组织还是细胞，其生物钟的运行都由存在于特定脑区的时钟中枢调控[26]。但是在分离培养的果蝇组织中，则发现细胞是具有自主时间的，表明果蝇的基本生物钟仍然是由每个细胞自己进行，同时受到中枢的统一调控的[27]。

图7 果蝇时钟元件的变化周期

    per作为最早被克隆的果蝇时钟基因，其时钟节律性也是了解最清楚的。在果蝇中，per与tim共同组成了生物钟的核心成分。per的表达从自我时钟的起点开始上升，其翻译出的PER蛋白也开始出现[28]，虽然per的表达会受到很多调控因素的影响，但它的激活主要是由的非同源二聚体蛋白CLK/CYC完成的[29]，CLK和CYC与N中的WC1/2蛋白非常相似，它们也都有PAS域，同样也经由PAS域形成聚合体[30]。然而，与WC1，2不同的是，CLK/CYC是以其bHLH域与时钟基因启动子的E盒元件结合并激活基因的转录的[29]。在果蝇细胞中，CYC蛋白的量几乎是恒定的，而CLK则随时间的变化而节律性变化[31]，CLK的缺乏可以导致per/tim的转录不能被激活[32]。PER蛋白翻译完成后就与TIM蛋白形成异源二聚体[33]，并进入核内。在核内的PER/TIM积累到一定浓度后可以与CLK/CYC发生相互作用从而阻断CLK/CYC对per/tim激活作用[34]，因此抑制了per/tim的转录。然而，PER/TIM的积累过程比较缓慢，per/tim的上升过程将持续9-11个小时。在per/tim到达顶峰后3小时PER/TIM的总量到达峰值[35]。在这个时候，不同于它们对per/tim转录的抑制作用，PER/TIM可以激活clk的转录并导致CLK蛋白量的同步上升[36]。然而高水平的PER/TIM使per/tim的表达此时仍在下降中，从而使PER/TIM的量也开始下降。随着PER/TIM的不断下降以及CLK/CYC的不断积累，最终CLK/CYC的量超过了PER/TIM并重新激活per/tim的转录，开始了下一个循环。影响时钟运行的还有一些其它基因。 PER蛋白在单独存在的时候并不稳定，这样PER/TIM的量就受到PER的稳定性和PER/TIM的入核速度的影响[37]。同时，在PER/TIM的形成过程中，它们不断被磷酸化。这种磷酸化是由另一个时钟元件dbt所介导。由于PER/TIM只有在磷酸化以后才能降解，所以磷酸化的速度也能影响PER/TIM的积累速度。在活性不完全的dbt突变体中，发现了欠磷酸化的TIM过量积聚的现象，同时，时钟循环变慢甚至停止[38]。

    对比果蝇和链胞霉的生物钟的运行，虽然都是以相似负反馈转录调节进行的，但差别也非常明显。对链胞霉而言，当frq基因缺失时，即使保留全部其它核心基因，亦不能恢复时钟的运行，但在果蝇中却发现per或tim的节律性表达并非时钟循环建立所必须的。在per基因的缺失体中转入由表达量恒定的启动子驱动的per基因即可恢复时钟的运行[39]。，甚至per基因缺失而又保留了时钟循环的突变体也被发现。不过不管怎么说，对绝大多数细胞，PER/TIM都是完整循环的重要组分，进一步的研究将会解释以上的问题。

    果蝇的核心时钟元件的激活是在晚上，那么光是怎样作用于时钟循环的呢?不同于链胞霉的光激活模型，果蝇采用的是光消去的方式。果蝇对于光的感受是通过眼完成的，在接受到来自眼的光信号后，细胞内的TIM会被很快地降解[40]，从而影响时钟的循环过程。实际上，直到接近傍晚的时候，光都可以通过导致的PER/TIM不能积累而造成循环上的延迟，而在深夜PER/TIM的下降过程中突然的光照会使PER/TIM几乎完全消失，将时钟拨向下一循环的开始。虽然具有PAS域，但并没有能够确定CLK/CYC象WC1，2那样参与了光信号的响应。直到最近才发现涉及这种作用的由类视黄素介导蓝光响应的cry基因。在与视黄素结合的区域对cry基因进行点突变使CRY不能结合视黄素时，果蝇就将具有相同的PER的节律性变化，无论在完全黑暗或明暗交替的环境下[41]，表明cry的确是果蝇的光授时因子。 果蝇与链胞霉一样也对温度敏感，而它对于温度的响应可能是由PER参与的[42]。在PER水平较高时，温度的突然上升会导致PER的降解，但在PER水平低时，这种作用就不敏感。所以，温度的作用并不能如光一般造成长期的延迟现象，它只能在前半夜PER/TIM处于峰值的时候造成短暂的延迟。然而，温度的变化究竟如何作用于PER目前还正在研究中。

    在时钟信号的输出方面，虽然已经发现了一系列的果蝇的时钟响应的基因如Dreg-5，Crg-1，lark等，但其中的大部分都是功能尚不明了。lark是已知功能ccg之一，它编译一个RNA结合的蛋白，这个蛋白参与果蝇的羽化过程。虽然lark的转录并非节律性变化，但其蛋白的量是节律变化的[43]。虽然lark并不直接参与改变果蝇的行为，但作为重要的生理过程，lark受时钟调控表明生物钟对高等生物的影响远非只是行为方面。