DHPLC技术用于DNA 片段分析[创新技巧]

DHPLC技术用于DNA 片段分析

一、 简介 

美国Transgenomic公司研制推出的WAVETM DNA片段分析系统（图1）建立了一套快速、自动化的核酸分析新方法和新标准。它利用高压液相色谱（HPLC）原理，通过一个DNA分离柱 ----- DNASepTM cartridge进行DNA的分离与分析。

在分子生物学研究和临床诊断等领域中，WAVE是一套进行DNA片段分析的完整的和全自动的系统。利用它可以对单链和双链核酸片段进行快速、准确和自动化的分离、分析和定量，可以进行突变检测、DNA片段大小的判定、基因表达定量和基因型分析（Genotyping）等。该系统应用的范围包括：遗传测试、癌症研究、种群分析、在临床样本中病毒核酸的定量、连锁作图、动物和植物生殖过程的分子检测、功能性基因组分析等等。WAVE的应用简示于图2。

该系统按两种方式对DNA片段进行分离：基于片段大小的不同和通过温度调控来分离纯合双链和杂合双链。与大规模测序技术不同，WAVE的DNA检测非常快速并且简单。单个核苷酸和短的串联重复多态性（SNPs，STRs）的检出是通过对杂合双链和纯合双链的分辩来实现的，而杂合双链和纯合双链的分离则是通过WAVE系统精确的温度控制，使杂合双链部分变性，从而与纯和双链分离开来。

整套仪器由泵、样品池、自动进样器、柱腔、DNASep柱、线内排气装置、紫外检测器组成，其内部的自动进样器样品池可以容纳96孔PCR板以便进行大规模的分析筛选。整套仪器完全由计算机控制，包括数据采集、分析实验结果、片段收集（选配）等，其专门软件操作简单而方便，功能完备。所有实验参数的电脑控制避免操作接触，并保证了实验结果的高度重复性，而且可以实时(Real time)观测数据。分析过程快速，5-7分钟内得到实验结果，大大减少整个工作时间。选配的自动收集器方便实验者回收目的片段，以进行后续的PCR、测序、亚克隆等分析和研究。

二、 原理 

1. 样品在WAVETM DNA片段分析系统进行分析的流程

在WAVE系统中，DNA片段由缓冲液带动流经整套装置，从而形成液相（流动相）。流动相是由高压泵来推动的，使缓冲液从储液瓶中开始，流经DNA分离柱和紫外检测器最后进入废液瓶。DNA片段的分离是在DNASep分离柱中进行的，DNA片段的检测是通过系统的紫外检测器，检测的信号转换成数字形式在电脑上显示并加以分析。其得到的结果与色谱相似，产生的一系列峰就对应于相应的DNA片段。样品在WAVE系统上进行分析的流程如图3所示。

2. 核酸片段的分离

通过HPLC原理来分离核酸最初是采用强的负离子交换剂，交换剂的选择是对应于DNA中带负电荷的磷酸根基团。然而用这一方法，A-T碱基对比C-G碱基对的滞留时间要长，这就导致在按片段长度分离的同时，DNA的分离也依赖于碱基顺序的组成。解决这一问题的方法是运用离子对反向高压液相色谱（Ion-pair reverse-phase HPLC，IR-RP-HPLC）技术和专利的DNASep柱。如图4所示，在洗脱液中含有阳离子Triethylammonium，它与DNA上带有负电荷的磷酸根基团相作用，同时也与柱填料的疏水表面相作用。Triethylammonium的作用就好象是联系DNA分子与分离柱填料之间的一个桥梁。当逐渐提高流动相的acetonitrile浓度的时候，流动相的有机成分更高，DNA就被洗脱下来，而片段越小，洗脱就越快。

3. 利用温度调控杂合双链分析（Temprature-Modulated Heteroduplex Analysis， TMHATM）的方法来检测遗传突变

WAVETM DNA片段分析系统可以在两种方式上进行DNA的分离：一方面在50°C的时候DNA按照片段大小不同得到分离；另一方面利用温度调控杂合双链分析（TMHATM）的方法可以分开纯合双链与杂合双链，从而检测到突变的存在。在原理上，应用DNASep柱进行突变检测与利用变梯度凝胶电泳（denaturing gradient gel-electrophoresis，DGGE）相似。突变的样品必须先同野生型的DNA杂交从而形成两种纯合双链和两种杂合双链的混合物，如图5所示。将这一混合物直接注射入DNASep柱在60°C左右进行分析，在这样升高温度的情况下，使错配的位点达到部分变性的条件。杂合双链由于存在错配的位点，在合适的温度下将会先部分解链，因此在纯合双链之前出峰。通过选择分析所采用温度，可以达到最佳分辨效果，因此这一技术被称为温度调控杂合双链分析（TMHATM），见图5。

三、 应用举例

1. 利用WAVETM DNA片段分析系统进行突变和多态性的检测

WAVETM DNA片段分析系统提供了一种快速，自动化的方法，即使在不知道突变类型和突变位点的情况下也可以检测出突变的发生。只要把野生型和突变型DNA混合杂交形成纯合双链与杂合双链，通过温度的调节和控制，即显示出突变的特定峰型。杂合的突变个体在一个基因位点中，野生型和突变型DNA的比例为1：1。将PCR产物升温至95°C然后缓慢降温，就形成了纯合双链和杂合双链的DNA混合物。而如果两个等位的位点都发生突变（纯合突变），这样的个体其DNA必须与野生型DNA混合并杂交。经过处理之后，样品就会成为含有杂合双链和纯合双链的混合物。然而，单纯来源于纯合野生型个体或者纯合突变型个体的DNA则只形成一种纯合的构型。WAVE系统能在几分钟内分辨纯合双链和杂合双链，这一能力就使它在突变检测的领域成为一个强有力的工具。

例如：利用WAVE来分析在人类Y染色体（Yq11）上DYS271位点的一个单碱基突变。图6显示了四种杂交产物随着实验温度变化而形成的不同的峰型。

在DNA片段分离采用非变性温度（51°C）以下时，所有的四种产物的保留时间是相同的。当温度升高到54°C时，杂合双链的DNA片段在错配的碱基处附近的区域开始解链，出现在这时仍然保持完整的纯合双链DNA之前。在56°C的时候纯合的DNA双链开始解链，A-T的野生型纯合双链解链快于G-C的纯

合双链。而到59°C以上纯合双链也全部解成单链，与杂合双链保留时间又再相同。这里的最佳分离条件是在57°C。

有四个重要的因素决定WAVE系统检测突变的效率：

（1）PCR引物设计

（2）PCR方法

（3）分离用的缓冲液梯度

（4）分离的温度

前两个因素与PCR样品制备相关，而后两个因素与样品分析过程相关。

2. 短的串联重复（STRs）DNA顺序的分离和纯化

短串联重复顺序（STRs）和微卫星（Microsatelites）是由一系列串联重复的寡核苷酸核心顺序组成的，常被用做遗传标记。STRs的检出一般是基于带有STR顺序的PCR产物长度的变化。利用测序的方法进行检测时，这PCR片段必须先纯化去盐、去除多余的dNTPs和去除多余的引物。另外，不同个体的基因型分析需要进一步的处理，使异源STR等位基因纯化出来，然后测序。WAVE系统可以通过温度调控（TMHATM）来分析杂合双链的形成，并且可以对PCR产物进行纯化，以用于自动核酸序列分析，这就使之成为一个研究STRs顺序的有力的工具。

利用DNAsep柱，通过温度调控形成杂合双链的原理对人第6号染色体的F13A01位点上的短串联重复（STRs）顺序进行了成功的分离和分析，并经过峰形捕获使产物得到纯化。它的等位基因重复的范围从3-20次不等，重复的顺序为AAAG。图7中的两个峰F13A（5,8）是在一个杂合个体的F13A01位点的两个等位基因5和8。如图所示，杂合双链比纯合双链先出峰。要进一步研究各产物的特性可以利用自动收集器，分步收集各个产物峰来做进一步分析。

3. 利用WAVETM DNA片段分析系统进行寡核苷酸的质量控制和纯化

寡核苷酸几乎是现代分子生物学使用的最广泛的物质之一，它们的用途还包括发展新型药物或作为诊断工具等。因此，合成的寡核苷酸质量就特别重要，检测其中是否存在错误顺序，或者从合成错误的顺序以及其它杂质中将所需的寡核苷酸纯化出来是非常必要的。所以就需要一种能够分离和分辨寡核苷酸的方法，而且该方法必须是快速、高效、廉价、自动化和灵敏的，有了这样的方法，将给分析生物学和生物工程带来长足的发展。

WAVETM DNA片段分析系统提供了一个有效的方法来检测寡核苷酸的纯度以及获得纯化的寡核苷酸产物。由自动合成仪合成的单链的寡核苷酸样品经常含有很多杂质，利用WAVE系统可以在几分钟内完成寡核苷酸的分离和分析，可以按不同片段大小或者按片段大小与顺序信息进行分离。通过WAVE来进行寡核苷酸的纯化和合成过程的质量控制非常方便、快速和灵敏，可以真正做到寡核苷酸制备的高产和优质，满足分子生物学和生物工程研究的需求。

4. 利用WAVETM DNA片段分析系统进行PCR的竞争性定量

临床和病理研究人员经常需要了解在不同组织中，正常和病理的条件下（例如肿瘤发生），基因表达水平的变化。利用RT-PCR技术，将个体的mRNA进行反转录和cDNA的PCR扩增，是一个分析mRNA的非常灵敏的方法，但它只能检测到很有限的表达信息，而不能提供可靠的基因表达的定量结果。PCR扩增的效率在每一批反应甚至每一次循环之间都不相同，而扩增效率的微小变化将导致最终产物量的极大改变。

这里阐述了一个精确和灵敏的方法，用以对在组织裂解物中的微量mRNA进行定量。通过RT-PCR，用一个与样品顺序相似的竞争性的片段，与样品进行同时等效的扩增反应。设计一个同源竞争片段，这样这一目的RNA类似物与目的基因共有一部分相同的顺序，同时也被同一对反应引物所识别。通常它是经过修饰改变一个限制酶位点或者改变两引物位点之间的间插序列的长度。

在图8中说明了竞争性定量PCR的概念。目的mRNA和竞争RNA同源片段经过反转录然后在同一个反应混合物中扩增。由于目的DNA和竞争分子之间的顺序同源性，两者以相同的效率被扩增，得到的最终比率与RT-PCR之前的起始混合物相同。而这个序列同源物也导致在形成目的片段纯合双链和竞争片段纯合双链的同时，也形成了杂合双链。目的片段、竞争片段和杂合双链的扩增信号首先必须被分离开来以便对每一种进行定量，然后推算出最开始目的基因表达的信息的量。只要知道预先所加入的竞争物的确切含量，按比例就可以计算出目的基因的含量。

在WAVETM DNA片段分析系统上应用温度调