用抑制性消减杂交捕获造血干细胞专一的基因

用抑制性消减杂交捕获造血干细胞专一的基因

    CLONTECH PCR-Select™ cDNA Subtraction Kit提供了选择性扩增差异表达基因的有效方法，可成功用于分离在造血干细胞中差异表达的基因。

    淋巴造血细胞不断的由其前体—造血干细胞（HSC）所补充。HSC可分化为各种血细胞，包括新的HSC。这些细胞是在个体发育时或骨髓移植后，已知用于形成和维持淋巴细胞和血细胞生成的基本细胞。在体内和体外试验中，小鼠HSC已按表型进行分类，并进一步确定特异性。然而产生其表型差异的分子机制及决定其自我更新和分化的基因尚属未知。为研究这些问题，我们成功地用抑制性消减杂交的方法比较并鉴别了小鼠HSC和骨髓（Whole Blood Marrow， HSG所在的微环境）中差异表达的基因。

    我们使用荧光细胞分选技术，从小鼠骨髓中分离了约2X10⁵个HSC细胞，并用未经处理的小鼠WBM细胞（约有5X10⁵个）作为对照。我们分离了两种细胞的总RNA，用SMART™ cDNA技术(8)合成了第一链全长cDNA。SMART技术使用了长程PCR（LD—PCR），适用于少量total RNA。 16次LD—PCR循环即可获得足量的cDNA用于抑制性消减杂交。为提高获得差异表达的低拷贝转录产物的几率，将转录产物的丰度进行平衡后，同样做一次抑制性消减杂交。使用PCR选择性扩增的方法，通过一轮消减杂交即可实现对差异表达基因的选择性扩增。PCR选择性扩增方法同样包含了抑制性PCR效应：无义PCR扩增将被特别设计的适配子所抑制。当实验材料数量有限时，同时使用抑制性消减杂交和cDNA预扩增尤其有用。

    经过两轮杂交，PCR扩增及PCR产物克隆之后，将这些克隆排列编号，转移至尼龙膜上。从用于消减的原始HSC和WBM cDNA制备探针，分别与上述的尼龙膜进行杂交。约25%的差异表达的克隆被测序。我们发现，已知序列行与新序列（包括少量来自线粒体与核糖体的“外源”序列）大致相等。我们同样发现已知的干细胞表面抗原，c-Kit受体及CD34抗原分别占已测序克隆的7%和3%。其他序列与来源于其他物种的已知基因（大多为人和大鼠）有一定的同源性。为证实差异表达，我们对二次分选的HSC和WBM细胞的独立样品进行了RT—PCR，发现在大多数（约95%）样品中，存在10至100倍的差异表达。我们同样进行了反向RNA印迹分析：用琼脂糖分离HSC和WBM的已扩增的cDNA，然后印迹至膜上，再与随机引物标记的候选基因片断杂交。反向RNA印迹分析肯定了RT—PCR的结果。我们发现，当要鉴别差异表达的基因时，抑制性消减杂交技术是一种强有力且高效的工具。特别是在RNA数量极少，须扩增的情况下，与SMART cDNA合成一起使用，可提供出色的实验结果。