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P53在肿瘤发生的作用
【字体： 大 中 小 】 时间：2000年06月30日 来源：
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许金飞
摘要：细胞增殖率和细胞死亡的相互协调维持着细胞的稳定的内环境。如果这个平衡失去了，那么就会发生细胞的癌变。这可能是由于促进生长的基因的改变，导致了组成性癌基因的激活而引起的，也有可能是由生长的负调控基因（如：抑癌基因）引起的。最近对于与癌症病因学相关的分子机制的研究，为深入了解癌症发生中的信号传导途径提供了方便。近年来的研究已经弄清楚了P53的基因和蛋白的结构。通过研究抑癌基因p53与其它癌基因和抑癌基因的分子机制，提出了不同的细胞死亡的机制。例如许多癌基因可通过激活p53依赖型的细胞凋亡机制而表现出潜在的诱导凋亡的能力。因此抑制肿瘤发生的机制可能是在细胞有恶化趋势时而激活凋亡。这些研究表明p53是一个重要的维持基因组稳定的因素。P53突变与癌症的发生有很大的关系。而且P53也受到了很多因素的调控。
关键词：P53、抑癌基因
1、P53的结构和功能
感染了SV40的细胞会发生恶性转化，来自这样的恶性细胞的巨大T抗原的抗体，能和细胞内的一种分子量为53kDa的蛋白免疫共沉淀，这种蛋白被称为P53蛋白[1]。人类的P53基因是一段20kb的DNA，定位于17号染色体的短臂上。这个基因由11个外显子组成，第一个外显子不编码蛋白，定位于离外显子2和11有8－10kb远的地方[2][3][4][5]。P53基因在进化中很保守。通过P53蛋白的氨基酸序列的种间比较，我们发现有五个高保守区，即13－23、117－142、171－181、239－250和270－286[6]，分别被称为I－V区。这五个保守区可能对P53的功能起着很关键的作用。人类的P53蛋白由393个氨基酸组成，包括四个主要的功能区。在N端是转录活性区（1－42AA〕，中间部分是序列特异性的DNA结合区（102－292AA〕，C端区包括一个寡聚区（323－356AA〕和一个调控区（360－383AA〕。
P53的N端区
N端区包括了转录活性区[7]，它的邻近区域可能对转录活性区行使最佳功能是必须的。酸性的N端转录区允许P53补充基底转录水平。在实验中注意到，TBP与P53的C末端区相互作用，同时还与它的活化区相互作用[8]。P53的N端还与单链DNA结合蛋白RP－A以及P62的转录修复因子TFIIH相互作用。腺病毒的E1B－55Kda蛋白，人类的MDM2蛋白和HBV的X蛋白结合到P53的N端区，并且阻止了它的转激活活性[9]。22和23位的氨基酸残基在P53结合E1B-55Kda和MDM2的过程中起了关键作用。另外，19、22和23位的氨基酸残基对于体内的P53蛋白的转录激活是必需的[10]。这三个残基还在体外与TATA相关因子TAFII60和TAFII40结合的过程中有作用。P53通过MDM2而进行的负调控有两条途径：一、MDM2结合到P53的活化区，而抑制了P53刺激转录的活力；二、MDM2对于P53的量起着中心的调控作用，因为癌蛋白的目的是使得P53的量迅速下降[11][12]。mdm2基因本身是被P53激活的，这就为P53活力的负调控提供了一条途径。这些结果可以解释为什么野生型的P53没有来自肿瘤的突变型的P53稳定，因为这个来自肿瘤的突变型的P53不能诱导MDM2的表达。另外，作为能转激活P53的因子也能抑制几种细胞的和病毒的转录[13]。
N端区域还包括了一个富含脯氨酸区，这个区域与SH3结合蛋白有着显著的相似性，而且它还是在几个实验系统中P53调控的细胞凋亡、抑制肿瘤细胞生长以及使刺瘤因子E6的含量的降低所必需的区域[14]。这个富含脯氨酸，并包括五个SH3结合的PXXP模体的区域，可能和一些信号转导途径中的因子（如，c-abl）有物理性的作用。虽然富含脯氨酸区的缺失并不影响到几个启动子（如，WAF1、mdm2、和BAX）的转激活活性，但是这确实改变了转录的抑制[15]。有趣的是，P53基因在72位氨基酸处具有多态性，这使得72位或者是Pro或者是Arg。以Arg代替Pro后去除了一个PXXP模体。最近发现在HPV诱导的有P53Arg纯合子的肿瘤中P53Arg比P53Pro对E6调节的量的下降更敏感。这和最近发现的至少在某些群落中Arg72的纯合子对刺瘤病毒相关的肿瘤发生比杂合子更敏感有关系[16]。
P53的中心区
在P53蛋白的大约102－292氨基酸残基的中心区域内，包括了四个保守区II－V。80－90％的能引起肿瘤的突变就发生在这个区域。而且，这个中心区还包括了能识别和结合一个一致的靶序列的DNA结合区。它还和抗蛋白酶解的核心区有关[17]。值得注意的是，中心区还有蛋白结合域的功能，并与SV40的巨大T抗原和胞内蛋白53BP1和53BP2相互作用。核心区包括了一个巨大的β三明治结构，它作为三个环状因子的骨架。第一个环是L1，它在大沟处于DNA结合。第二个环是L2它在小沟处与DNA结合。第三个环是L3，它与L1相对，并稳定它的结构。L2和L3通过一个锌原子与四个氨基酸残基〔Cys176、His179、Cys238、和Cys242〕的相互作用而连接在一起。这个锌原子稳定了这些环的结构。锌离子的作用可以通过，金属螯合剂阻止序列特异的DNA结合的现象，和因抗体的作用而观察到的构象的改变的现象，而得到证实[18][19]。
三维结构最有用的特征是与突变有关的数据。一个主要的观察现象是环区与高保守区重叠，绝大多数的突变都发生在三个环区。有两类的突变是通过这样的结构知识而获得的：第一类影响与DNA直接接触的残基，这包括在P53中经常突变的Arg248和Arg273；第二类突变影响不直接与DNA结合的残基，但是DNA与多肽链中的其它残基会相互作用，并且对蛋白质结构有很强的稳定性作用。
DNA和保留有野生型构象的突变型P53接触，并且和真正的野生型P53形成稳定的复合物。而且突变型和野生型的P53的混合复合物能结合一个特别的DNA靶序列，显示了DNA接触突变型的P53不能干涉野生型的P53的功能。相反结构上的突变能够对野生型的P53产生显著的负效应。结构上的突变改变了P53蛋白的构象，并产生了能和单克隆抗体pAb240反应的蛋白。PAb240的抗原决定部位（AA 212－217）在野生型的结构中不能和这种抗体结合[20]。失去野生型的构象还能通过两个事实证明，即不能和对大鼠和人类特异的单克隆抗体pAb1620反应，不能和鼠特异的单克隆抗体pAb246反应[21]。
P53的羧端区
羧端区（AA300－313）包括：一个可变区（AA.300－318），连接中部的核心区和C－端区，一个四聚区（AA323－356）。P53通过一个寡聚区形成了四聚体。四聚体的结构已经通过核磁共振和X衍射晶体图谱阐明。P53形成了一个高对称的四聚体。每一个单体有一个回折（Asp324-Gly325），一个b折叠（Glu326-Arg353），第二个回折（Gly334）和一个a螺旋（Arg335-Gly336）。两条单肽链形成一个二聚体，这个二聚体中a螺旋和b折叠是反平行的，两个二聚体通过a螺旋相互作用形成一个四聚体，b折叠存在于四聚体外相对的两面。这样，这个四聚体可描述成二聚体的二聚体，两个二聚体通过a螺旋相互作用形成一个四螺旋束。四聚体在体内是有效的转激活和P53调控的肿瘤细胞系的生长的抑制所必须的[22]。要注意的是在C端区发现了三个核定位信号（NLS1、NLS2、NLS3）。大多数的N端信号（NLS1，AA316－325）的突变发生诱导了整体的胞质P53蛋白的合成。改变NLS2（AA369－375）和NLS3（AA379－384）导致P53在胞质和核都有定位[23]。
和寡聚区（AA323－356）邻近的部位有个区域（AA 363－393）被认为是凋亡区域，一个转录调控区或一个DNA损伤识别区。这个C端区似乎是一个P53序列特异结合的负调控区，这个观点可以通过P53和抗P53的单克隆抗体pAb421的结合，能激活特异的DNA结合而进一步得到证明[24]。
根据P53活力调控的异构模型[25]，在P53的四聚体中C端区和其它区的相互作用锁定了四聚体结构。在培养的动物细胞中，P53的激活和磷酸化、乙酰基化、糖基化和C末端的蛋白酶解有关。这些修饰被认为是通过改变蛋白质的构象而激活P53的，这是一个异构因素的调控。一些病毒和胞内蛋白，包括肝脏B病毒（HBV）的X蛋白、TFIIH的亚基XPD和XPB（在体内是两个螺旋酶）、TBP能和P53的C端区结合[26]。
2、P53是一个抑癌基因
P53作为一个结合SV40 T抗原的肿瘤抗原首先发现于1979年。在二十世纪八十年代，P53重新被认为是一个肿瘤抑制基因，因为它是人类肿瘤发生中突变频率最高的基因。野生型P53功能的丧失在大约50％的人类原癌中发生[27]。通过在高保守区内的点突变和通过结合细胞的和病毒的癌蛋白而使得P53失活是十分常见的。多种DNA肿瘤病毒编码转化癌蛋白，使其与P53相互作用并使P53失活。这些病毒包括：SV40 Tag、癌基因HPV E6、来自腺病毒的EIB 55kDa蛋白、来自Epstein Barr 病毒的EBNA 5、来自人类巨细胞病毒的IE84、和来自HBV的HBX。在P53中有胎系突变的病人，例如Li-Fraumeni 综合症，和老鼠缺乏P53的功能一样显示出很高的恶性转化率[28]。正常的P53功能的丧失导致基因组不稳定性的增加，因为基因扩增频率、染色体重组率和突变率以及中心粒的异常复制率会升高[29]。因此，P53通常被认为是基因组的守卫，是一个在对DNA的损伤应答的调控中起着重要作用的因子。最近的研究弄清楚了P53调控肿瘤抑制支路的机制，增加了我们的有关人类癌症的病原、诊断、预后、和治疗等方面的知识。
我们知道P53是一个DNA损伤应答支路的成员，和维持基因组的完整有关。胞内的对于有基因毒性的试剂的回应，可通过阻止P53的降解，而使得整体的P53含量的增加。阻止P53的降解的机制有部分是，通过激活P53的N端被DNA依赖型的蛋白激酶和ATM激酶（由共济失调毛细管扩张突变基因编码）磷酸化，这阻止了它和MDM2（一个在人类肿瘤中过量表达的细胞癌基因）的结合，并阻止了MDM2调控的降解[30]。然后，P53开始了几种保护机制（如：细胞周期控制、DNA的修复和细胞凋亡）来执行它的肿瘤抑制功能。最近的有关P53调控细胞周期和凋亡的机制的研究揭示了这些途径是混合的。P53功能的行使可能需要依赖于转录和不依赖于转录的信号网络。
依赖转录型的机制
P53可作为一个转录因子是一个具有划时代意义的发现。P53包括了一个酸性转录激活区，这和典型的转录因子很相似[31]。这些区域包括了几个磷酸化位点，这些位点也是DNA－PK、ATM激酶、CK－1的作用位点，也和结合MDM2有关。野生型的P53识别一个特异的具有较强的一致性的，并包括一个特别的对称模型的DNA序列。有趣的是，有很多错义突变发生的核心区域（AA 100－300），它与DNA序列特异结合有关[32]。特异的DNA结合也是转录激活所必须的，大多数热点突变已经丢失了它们的DNA序列特异结合的特性。而且，鉴定对转录激活必需的核定位信号和寡聚域显示了P53是一个转录因子。
有报道说许多基因被P53在转录水平上转激活，包括肌肉肌氨酸酐酶基因，GADD45、MDM－2、p21、CYCLIN GI、BAX、FAS、TGF－ALPHA、IGF－BP3、WIPI、DR5、14－3－3σ。由离子辐射、紫外辐射和DNA损伤试剂造成的DNA损伤可以导致P53蛋白的迅速聚集，并在核中被活化。然后，P53反过来转激活下游的基因，其产物与肿瘤抑制有关。Polyak 等人最近用一系列基因表达评估分析的方法，显示了P53在转录水平上激活一些在结肠癌细胞系中的基因[33]。这些基因中的绝大多数能编码对氧化压力有应答的蛋白。有趣的是，早期报道的能被P53正调控的基因只能被部分地探测到（如：MDM2），或者完全探测不到。这有可能是这些被P53诱导的基因是细胞类型特异性的，也可能依赖于细胞所处的条件。
不依赖于转录的机制
细胞功能的调制是通过蛋白与蛋白间的相互作用来实现的。因为每个细胞的P53分子数目是有限的（大约每个细胞有10,000个），而且当DNA受到损伤时P53会在很短的时间内上升到一个很高的水平。蛋白与蛋白的相互作用的机制似乎是一个P53调制细胞功能的有效的机制。实验显示，P53与胞内的可能在P53调节的不依赖转录的途径中起重要作用的蛋白相互作用。第一个P53结合蛋白被确认为是70kDa的热休克蛋白（hsp70），它和P53的某个突变体结合。MDM2能结合野生型和突变型的P53，并阻断P53调节的转激活功能[34]。这个关系被认为是负反馈调控途径来调节P53的功能。几个基底转录因子包括TATA结合蛋白（TBP）、TBP相关蛋白、CCAAT结合蛋白（CBP）、TFIIH相关因子p62和SP1都能和P53形成复合物。P53与TBP的结合和P53调控的转录抑制有关。被P53在转录水平上抑制的基因包括：白细胞介素6基因、增殖细胞核抗原基因、视网膜肉瘤基因、多种抗药基因、C－FOS、BCL－2、可诱导的一氧化氮合成酶基因。某些基因被P53有选择的抑制，可能是调控这些基因产物的一个重要事件。复制蛋白A（Replication protein A，RPA）结合P53的发现提供了这样的可能性，即P53可能在DNA的复制和核苷酸切除修复中起着直接的作用[35]。P53还能和其他的TFIIH相关因子包括XPB和XPD相结合。这在基底转录、DNA修复和细胞凋亡的过程中起着重要作用。另外，Wilms肿瘤抑制基因的产物WT1也能和P53结合[36]。然而，P53调节WT1功能的机制还不清楚。P53与RAD54、RAD51的结合还和DNA的同源重组有关。P53与RAD54、RAD51的结合与P53可能和影响DNA同源重组的蛋白相互作用的假说相一致。
3、P53受很多因素的调控
3.1 MDM2对P53的调控
MDM2是P53这个肿瘤抑制蛋白的主要调控者。MDM2是怎样控制P53的功能的呢？在回答这个问题之前，我们需要简单地回顾一下P53的基本功能。许许多多的证据显示了P53是一个检查点基因[37]。在对DNA损伤和其他类型的困境（例如：热休克、缺氧、氧过多）的应答中，P53会阻止细胞周期的运行或者会引起细胞凋亡。在对绝大多数的困境应答时，P53蛋白会在1－12小时内增加。这样高水平的P53归功于P53翻译效率的增加和降解速率的降低[38]。
MDM2在P53的降解中发挥了主要的作用。MDM2结合在P53的N端，并充当泛素裂解酶[39]。泛素是一个具有76个氨基酸残基的蛋白，它与底物蛋白的氨基共价结合。泛素标记的蛋白会被存在于胞质内的26S的蛋白体迅速地降解。许多蛋白包括P53可被26S的蛋白体降解。在导致P53蛋白酶解的一个步骤中，一个泛素残基被从MDM2的Cys转移到P53。突变发生的研究显示了在MDM2中高保守区的Cys464残基，对转移泛素到P53[39]和在培养细胞中调控P53的降解都是必须的[40]。
P53除了被MDM2泛素化外，有五个证据显示了MDM2导致了P53的降解：（1）编码P53的N端缺失的突变体的cDNA在培养的细胞中表达，产生的突变体P53的半衰期变大了；（2）在细胞中显微注射中性的MDM2的抗体，或者用阻止MDM2－P53复合物形成的多肽，可以提高P53蛋白的含量；（3）用MDM2的转录的反义表达结构处理后的细胞，也有较高的P53蛋白含量；（4）转染了编码MDM2基因的cDNA的重组体中，MDM2的过量表达会使P53的含量降低；（5）MDM2的P53结合域被损害的突变体cDNA在细胞中表达，不能使P53处于低含量水平。
仅仅是MDM2和P53间形成复合体，还不足于调控P53的降解。一系列的报道显示了一个模型，即为了P53的降解能发生，P53－MDM2复合物必定被从细胞核转运到细胞质[41]。根据这个模型，MDM2不停地在胞质和核之间的穿梭，归因于MDM2编码了核定位信号〔NLS〕和核输出信号（NES）。MDM2的NES的突变增加了P53的稳定性，并导致了P53在核中的聚集[41]。有一种被用来探测这个控制P53含量的模型的工具是，一种被称为细霉素B的抗生素。它结合并阻止一个被称为CRM1的关键的核输出蛋白。用细霉素B培养的细胞导致了P53在核内的增加并激活P53调控的转激活。这显示了CRM1也和P53的核输出有关。其他的实验发现，在缺乏MDM2时P53自身含有的NES足以使它输出核外[42]。在一个不依赖于MDM2的核输出调控的模型中，P53自我聚合形成四聚体覆盖住它的NES而使得P53保留在细胞核中。当P53的四聚体被转变成二聚体或单体时，NES被暴露，从而使得核输出发生。
3.2 P53的核输入
在人类P53的C端，已经鉴定到有三个区的氨基酸具有潜在的核定位信号（NLS）。主要的NLS是316－321AA（NLS1），它在种属间是高保守的，并且和其他的核内蛋白的NLS有很高的同源性。如果将NLS与胞质蛋白融合，形成的融合体会定位于核内。NLS2（AA 370－375）和NLS3（AA 379－384）具有较低的保守性，它们对核输入的效率也较抵。
然而几个报道已经显示了尽管有完整的NLS存在，在P53中的NLS以外的其他的突变也能增加P53在胞质中的定位。P53的C末端的突变分析表明，在对P53的核定位有贡献的三个NLS以外，还有其它的残基对核定位有贡献。Lys305和Arg306被替代后导致了P53与细胞质隔绝。最近有报道说，来自Burkitt淋巴瘤的人类B细胞系的一个P53的突变体（Arg283His）被细胞核排斥。有趣的是，这个特别的突变体能够结合DNA，能够转激活P53应答基因，还能诱导细胞凋亡，这说明Arg283His突变体产生了核与胞质穿梭的缺陷[43]。
有几个观察结果暗示了其他的因子也会促进P53的核定位。实际上，SV40的巨大T抗原有利于野生型P53的核输入，而不利于突变型P53的核输入。在另一个实验中，在转化鼠的细胞中的P53的温度敏感型的点突变显示了，32℃时P53定位在核中而在温度变成37℃时P53定位在胞质中[44]。值得注意的是，37℃时蛋白质合成被抑制，也会导致突变的P53在核中聚集，这说明蛋白的合成对P53从核转运到胞质并不是必须的，37℃时在胞质中的一个短命蛋白负责留住P53。
3.3 P53的核输出
癌蛋白HDM2在P53的降解中发挥了主要作用。HDM2不停地在核和胞质间穿梭，它包括一个HIV－1 REV蛋白型的核输出信号[45]。另一方面，LMB的增加会导致在人类成纤维细胞原癌和其他表达野生型P53的细胞系中，P53在核中聚集。而且，LMB阻止了过量表达MDM2蛋白的细胞中的P53的降解[46]。这些数据以及有关HDM2的NES中有突变后不能调节P53的降解的观察结果，说明HDM2使P53不稳定需要P53的核输出，或者至少需要HDM2与核输出机器相互作用。然而，HDM2并不是唯一的促进P53核输出的因子。最近G.Wahl的实验室报导了P53的核输出，是由在P53的四聚结构域的α螺旋结构中的NES调控的[47]。这些NES的突变阻止了P53的四聚体形成，消除了P53的核定位和核输出。既然不能和HDM2结合的P53突变体在用LMB处理后会在核中聚集，人们推测NES对于P53的核输出不仅是必须的而且是足够的。P53四聚化后P53的NES被覆盖住，P53的核定位就加强了。P53功能的减弱可能和四聚体向二聚体或单体转变有关。因为在二聚体或单体中P53的NES能够和调控核输出的一些因子结合。P53有效的四聚化可能不仅是MDM2调控的泛素化必须的，而且也是核输出必须的。人们对于HDM2和P53是通过它们各自的NES相互独立地输出核，然后在胞质中结合，还是在核中P53与HDM2结合，然后共同穿梭到胞质中使P53开始降解，不是很清楚。虽然HDM2的含量在正常细胞中较低，但是它还是能被检测到。这进一步说明，在正常的细胞增殖中HDM2调节了P53的降解。
3.4 P53的磷酸化
有几个蛋白激酶可以在体外使得P53的不同的结构域磷酸化。例如，DNA激活蛋白激酶，ATM激酶和酪蛋白激酶（CK）等，每一个激酶都能使P53的N端转激活区域的不同位点磷酸化[48]。这些磷酸化影响了P53的转激活活性。例如在大鼠中P53N端的三个磷酸化位点－Ser氨基酸残基，被突变为Ala后，导致了肿瘤抑制功能的显著下降，也导致了转激活活力的下降[49]。P53的C端调控区是酪蛋白激酶2的磷酸化靶位点。蛋白激酶C（PKC）、细胞周期依赖型的激酶（CDK）和p34cdc2能在体内与P53结合，在体外使P53磷酸化。在体外P53被PKC和CK2磷酸化后可能通过改变蛋白质的构象而促进其与DNA的结合。
3.5 氧化还原对P53的调控
DNA的结合活力和P53的构象，还会受到蛋白质氧化还原状态 牡骺亍５鞍椎难趸嶙柚笵NA的结合，而还原会有利于DNA的结合[50]。在DNA结合结构域的核心部位有几个半胱氨酸可以和锌离子共价结合，突变分析已经鉴定了173、235和239位的Cys参与了DNA的结合，它们也是转录激活和抑制细胞转化的关键因素。P53可能不但被氧化剂调控，还会被细胞的抗氧化的防御系统调控。另外，其他的研究显示一些氧化还原敏感的蛋白（如：HIF-1α和Ref-1）能够和P53相互作用，并且改变它的活力和含量[51]。
4、P53的突变和一些癌症的发生
在许多人类的癌症中P53都有突变。在恶性细胞中大多数的突变是错义突变，产生了一个被改变了的蛋白，然后第二个等位基因会丢失，突变的基因就变成了纯和体。改变P53的功能的突变发生在这个分子的很大的区域内，尤其是高保守区。使蛋白缺失一段序列的移码突变和无义突变不发生在这些区域。已经报道了有相当数量的P53突变，其中有一些突变比其他的突变有更高的突变率（包括在175、249、273和282的密码子）。在人类癌症中这些残基的突变占所有错义突变的40％。要注意的是，这里有组织特异的热点突变。
首先提出恶性细胞与P53有关系的是Harris、Ozturk和他们的同事。他们发现在来自南非和东亚的肝癌中密码子249位上的G转变为T，有很高的转变率，从而使得Arg经常转变成了Ser[52]。另一个例子是，Brash等人研究的P53与人类鳞片状癌症的关系。他们发现58％的皮肤的鳞片状细胞癌中包含有P53基因的突变，每一种突变都改变了氨基酸序列。有三种肿瘤的发生是由于紫外光照射后CC碱基对变成了TT碱基对。在其他类型的肿瘤中的P53的分析增加了我们对于肿瘤发生和P53的突变之间关系的了解。总之，P53的突变可能会造成肿瘤的发生。
5、总结与展望
到目前为止，我们已经在阐明P53的生物化学和生物学特性方面取得了很大的进展。P53在癌症的发生中起着关键的作用，在由DNA损伤引起的细胞周期调控中起着中心作用。阐明P53所有结构的构象是很有价值的。研究P53和许多癌基因的信号传导途径使我们能更好地理解癌症发生的基本途径。现有的数据表明P53是在细胞面临压力时，调控其凋亡的一个基本的因子。进一步研究P53的精确的作用机制，可以为癌症的治疗提供更好的手段。
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