基因疗法（下）

(续前）压 缩 的 DNA 颗 粒 

    许 多 阳 离 子 化 合 物 被 用 于 以 静 电 作 用 压 缩 DNA 至 小 颗 粒 ，这 样 有 助 于 防 止 DNA 降 解 以 及 有 利 于 它 通 过 内 吞 作 用 被 细 胞 摄 入 。最 常 用 的 多 聚 物 是 异 源 多 聚 赖 氨 酸 、一 定 长 度 的 寡 肽 、 多 聚 乙 醇 亚 胺（PEI）。有 大 量 报 导 称 ，在 in vitro 实 验 中 ，无 限 增 殖 化 细 胞 系 能 被 以 上 所 有 多 聚 物 产 物 有 效 转 染 ，但 仅 有 一 两 种 多 聚 物 在 初 级 细 胞 的 ex vivo 实 验 中 有 效 。在 in vivo 实 验 中 ，该 方 案 转 染 效 率 不 如 裸 DNA ，因 为 在 生 理 条 件 下 颗 粒 会 发 生 聚 集 ，体 积 大 到 不 能 渗 入 大 多 数 组 织 并 被 细 胞 有 效 吸 收 。即 使 进 入 胞 内 ，也 会 包 裹 在 内 吞 体 中 ，需 要 外 加 特 殊 试 剂 ，例 如 氯 奎 使 内 吞 体 破 裂 释 放 颗 粒，从 而 达 到 有 效 转 染 。而 这 显 然 只 能 在 in vitro 中 进 行 ，而 不 能 在 in vivo 中 进 行 。细 胞 核 对 外 来 DNA 的 吸 收 也 限 制 了 转 染 效 率 ，这 个 问 题 同 样 存 在 于 大 多 数 其 它 的 非 病 毒 载 体 中 。这 种 方 案 的 主 要 优 势 在 于 生 产 工 艺 成 熟 ，而 且 通 过 在 DNA 压 缩 肽 上 联 结 靶 向 配 基 或 细 胞 间 运 输 增 强 子 ，能 显 著 改 善 其 转 染 的 特 异 性 和 效 率 。目 前 ，采 用 PEI 的 方 案 最 为 普 遍 ，当 载 体 颗 粒 被 注 入 小 鼠 尾 静 脉 后 ，可 在 其 肺 部 血 管 壁 上 观 察 到 明 显 的 转 染 ，进 一 步 的 临 床 实 验 还 有 待 进 行。

无 针 注 射 法 
    该 方 法 有 两 种 方 案 。一 种 方 案 采 用 高 压 氦 气 流 将 用 金 颗 粒 包 被 的 DNA 直 接 导 入 胞 质 中 ，这 种 方 法 也 叫 基 因 枪 法 。另 一 种 叫 Intrajet 或 Jetgun ，采 用 高 压 液 流 将 DNA 送 入 组 织 间 隙 中 。基 因 枪 法 在 ex vivo 中 转 染 效 果 尚 可 ，而 在 in vivo 中 仅 对 皮 肤 细 胞 有 效 。这 些 皮 肤 细 胞 包 括 朗 氏 细 胞 ，它 是 一 种 抗 原 呈 递 细 胞 。 基 因 枪 法 有 希 望 替 代 裸 DNA 法 ，用 于 将 抗 原 基 因 导 入 体 内 作 为 疫 苗 。以 上 两 种 方 案 在 初 步 的 临 床 实 验 中 均 能 有 效 的 激 发 免 疫 反 应 ，而 相 比 之 下 ，基 因 枪 法 需 要 的 DNA 剂 量 较 少 。也 有 报 导 称 在 小 鼠 实 验 中 ，液 流 法 比 基 因 枪 法 能 激 起 更 强 的 免 疫 反 应 ，它 还 在 进 一 步 发 展 中 。

电 穿 孔 法

    在 in vitro 实 验 中 用 电 场 作 用 于 细 胞 壁 能 使 其 短 暂 开 口 ，由 此 外 源 DNA 可 进 入 胞 质 内 。电 穿 孔 法 用 于 转 基 因 研 究 已 持 续 多 年 ，但 尚 未 广 泛 应 用 于 基 因 治 疗 ，部 分 原 因 是 其 流 程 对 大 部 分 细 胞 不 适 用 。近 期 新 的 装 置 和 流 程 已 被 发 展 起 来 ，在 in vitro 中 能 减 低 对 细 胞 的 损 害 。有 报 导 称 该 方 法 已 在 小 鼠 的 皮 肤 和 肿 瘤 上 取 得 了 大 为 改 善 的 转 染 效 果 。该 方 法 的 一 个 重 要 潜 在 应 用 价 值 在 于 它 能 在 ex vivo 中 稳 定 转 染 干 细 胞 ，并 在 其 染 色 体 上 有 效 的 插 入 转 基 因 。

展 望 
    过 去 两 年 中 ，载 体 生 产 工 艺 有 了 长 足 进 步 ，RCV 生 成 减 少，Ad 、Rv 、AAV 载 体 产 量 上 升 。这 使 得 在 临 床 应 用 时 ，不 再 因 为 载 体 的 质 和 量 而 受 限 制 。 当 前 基 因 疗 法 的 主 要 途 径 有 ：

1、通 过 对 癌 症 的 局 部 给 药 ，利 用 Ad 载 体 搭 载 的 基 因 直 接 杀 死 肿 瘤 细 胞 。

2、利 用 裸 DNA 或 基 因 枪 法 产 生 对 抗 传 染 性 疾 病 的 预 防 性 疫 苗 。 

3、利 用 裸 DNA 法 改 善 心 血 管 疾 病 症 状 ，增 强 成 血 管 作 用 。

4、AAV 用 于 治 疗 慢 性 病 ，例 如 血 友 病 和 贫 血 症 。 

    目 前 尚 无 一 种 载 体 对 所 有 类 型 的 疾 病 均 有 效 ，而 未 来 几 年 内 出 现 这 种 载 体 的 可 能 性 微 乎 其 微 。Ad 载 体 对 于 只 需 短 期 表 达 的 in vivo 治 疗 最 为 有 效 ，若 加 入 辅 助 元 件 使 其 具 有 细 胞 特 异 性 和 表 达 特 异 性 ，并 减 少 免 疫 反 应 ，这 将 大 大 增 进 Ad 载 体 功 效 ，但 对 于 慢 性 疾 病 的 长 期 治 疗 可 能 仍 能 为 力 。AAV 可 能 是 最 有 效 的 缺 陷 基 因 替 换 载 体 ，如 果 只 需 小 片 段 转 基 因 的 话 。 

    大 部 分 进 入 二 期 临 床 阶 段 的 基 因 疗 涉 及 in vivo 的 转 基 因 。随 着 Ad 、AAV 载 体 的 in vivo 转 基 因 效 率 达 到 改 善 ，预 计 未 来 将 出 现 更 多 的 in vivo 疗 法 。作 用 于 干 细 胞 的 ex vivo 疗 法 的 改 进 也 将 同 时 进 行 。造 血 干 细 胞 的 制 备 在 医 疗 机 构 中 已 成 为 常 规 操 作 ，而 鉴 别 和 繁 殖 新 品 种 的 人 类 干 细 胞 ，包 括 从 胚 胎 或 胎 儿 组 织 中 衍 生 而 来 的 全 能 干 细 胞 ，已 取 得 重 大 进 展 。新 近 发 展 的 Lv 载 体 ，不 同 于 其 Rv 祖 先 ，能 整 合 转 染 到 静 息 期 的 造 血 干 细 胞 染 色 体 上 。将 Lv 转 染 的 细 胞 接 种 到 小 鼠 上 ，转 基 因 能 在 几 个 子 代 细 胞 中 表 达 。这 种 载 体 发 展 很 快 ，但 由 于 它 们 来 自 于 免 疫 缺 陷 病 毒 ，因 而 使 其 安 全 问 题 尤 为 突 出 。为 此 ，生 产 细 胞 经 过 了 一 系 列 改 造 ，使 其 彻 底 避 免 了 RCV 的 形 成 并 使 病 毒 自 我 失 活 。 

    对 于 整 合 型 载 体 来 说 ，当 其 搭 载 的 治 疗 基 因 整 合 进 入 处 于 紧 缩 状 态 的 不 活 泼 染 色 体 时 ，转 基 因 的 表 达 受 到 极 大 的 抑 制 ，不 管 是 在 in vivo 还 是 在 ex vivo 中 。染 色 体 开 放 元 件 能 改 变 染 色 体 结 构 并 使 其 活 化 ，因 此 它 对 于 解 决 这 一 问 题 极 有 裨 益 。这 一 元 件 包 括 两 种 类 型 ：1、位 点 控 制 区 LCRs ，2、广 泛 起 作 用 的 染 色 体 开 放 元 件 UCOEs 。LCRs 能 开 放 染 色 体 ，促 使 基 因 组 织 专 一 性 的 持 续 表 达 。UCOEs 在 广 泛 的 组 织 内 起 同 样 作 用 。LCRs 几 年 前 被 发 现 ，实 验 证 明 它 能 在 几 种 组 织 内 专 一 性 的 表 达 。这 使 得 临 床 实 验 中 干 细 胞 转 基 因 的 持 续 表 达 成 为 可 能 。UCOEs 是 最 近 发 现 的 ，它 有 希 望 使 一 系 列 载 体 的 转 基 因 表 达 得 以 改 善 。 

    将 染 色 体 开 放 元 件 与 可 诱 导 的 启 动 子 系 统 加 以 结 合 ，可 大 大 增 强 后 者 的 功 效 。这 种 重 组 的 启 动 子 能 使 转 基 因 的 表 达 受 外 源 物 质 的 诱 导 ，甚 至 有 可 能 被 口 服 的 活 性 小 分 子 所 激 活 。对 小 鼠 或 猴 导 入 用 AAV 作 载 体 的 促 红 细 胞 生 成 素 基 因 ，利 用 这 一 技 术 能 使 其 高 效 表 达 并 持 续 数 月 之 久 。现 在 ，基 因 疗 法 长 期 以 来 的 目 标 有 了 实 现 的 可 能 ，那 就 是 转 基 因 能 长 期 保 持 沉 默 ，而 又 能 随 人 们 的 意 愿 随 时 被 激 活 。 

    目 前 非 病 毒 型 载 体 的 in vivo 转 基 因 效 果 不 佳 ，而 随 着 压 缩 型 DNA 颗 粒 等 新 技 术 的 应 用 ，这 一 障 碍 有 望 在 几 年 内 得 以 解 决 。以 长 远 眼 光 来 看 ，非 病 毒 型 载 体 很 适 合 商 品 化 ，因 为 未 来 它 们 将 比 病 毒 型 载 体 具 有 更 高 的 特 异 性 ，更 低 的 免 疫 原 性 ，易 于 大 规 模 生 产 且 价 格 低 廉 。非 病 毒 型 载 体 需 要 解 决 的 主 要 问 题 是 延 长 其 表 达 期 ，而 目 前 其 表 达 期 仅 数 天 之 久 。这 是 因 为 现 在 的 非 病 毒 型 载 体 既 不 能 整 合 又 不 能 染 色 体 外 复 制 ，因 而 很 快 便 降 解 了 。近 来 一 直 在 发 展 可 复 制 型 游 离 载 体 REVs ，它 基 于 致 癌 病 毒 例 如 EBV 和 SV40 以 及 哺 乳 动 物 人 工 染 色 体 MACs 。目 前 ，REVs 的 稳 定 性 和 安 全 性 不 够 ；MACs 太 大 ，达 几Mbs ， 不 能 有 效 操 纵 、生 产 和 导 入 靶 细 胞 内 。 

    一 种 处 于 初 步 开 发 阶 段 的 方 案 试 图 将 非 病 毒 载 体 的 插 入 DNA 片 段 大 容 量 特 性 与 AAV 载 体 的 位 点 特 异 性 整 合 特 性 加 以 结 合 ，以 获 得 一 种 能 持 续 表 达 的 安 全 的 转 基 因 载 体 。这 种 载 体 之 间 的 杂 合 优 势 将 继 续 得 到 发 展 。在 这 方 面 还 有 两 个 例 子 值 得 一 提 ：一 是 利 用 Ad 将 Rv 的 基 本 结 构 基 因 和 包 装 基 因 导 入 靶 细 胞 中 ，而 目 标 转 基 因 则 存 在 于 Rv 的 基 本 结 构 基 因 中 。这 种 组 合 型 载 体 将 靶 细 胞 变 为 生 产 细 胞 ，能 稳 定 的 产 生 Rv 来 感 染 邻 近 细 胞 。因 此 这 种 载 体 既 有 Ad 易 于 生 产 和 in vivo 转 基 因 效 率 高 的 优 点 ，又 有 Rv 转 基 因 表 达 稳 定 的 特 点 。第 二 个 例 子 是 用 Ad 传 送 前 REV ，后 者 在 转 染 细 胞 中 通 过 位 点 特 异 性 重 组 从 病 毒 基 因 组 中 释 放 出 来 。这 使 得 细 胞 分 裂 后 的 子 代 细 胞 能 更 稳 定 的 表 达 转 基 因 ，而 又 不 表 达 其 它 Ad 基 因 以 免 引 发 CTL 反 应 。目 前 正 在 开 发 更 适 于 人 体 的 方 法 。 

    可 以 肯 定 的 是 ，未 来 几 年 新 开 发 的 临 床 方 法 将 主 要 用 于 基 因 添 加 ，而 不 是 基 因 置 换 或 基 因 修 复 。AAV 通 过 侧 翼 序 列 的 同 源 重 组 能 有 效 的 进 行 DNA 置 换 ， 也 许 这 和 它 能 将 大 量 单 链 DNA 导 入 细 胞 核 内 有 关 。约 1 % 的 人 类 成 纤 维 细 胞 的 DNA 置 换 是 精 确 和 可 遗 传 的 。到 目 前 为 止 ，in vitro 的 类 似 实 验 只 能 置 换 很 短 的 靶 序 列 ，但 成 果 仍 令 人 鼓 舞 。另 一 种 方 案 导 入 的 是 一 种 DNA－RNA 双 链 嵌 合 寡 核 苷 酸 ，其 中 RNA 提 供 靶 向 同 源 性 ，DNA 与 靶 序 列 之 间 有 一 个 单 碱 基 对 错 配 ，然 后 通 过 错 配 修 复 进 行 基 因 修 复 ，这 比 上 述 的 同 源 重 组 修 复 具 有 更 高 的 效 率 。据 报 道 ，采 用 这 一 方 法 ，10 % 的 初 级 血 细 胞 能 得 到 修 复 ，而 对 大 鼠 进 行 in vivo 实 验 ，约 40 % 的 肝 细 胞 得 到 修 复 。这 一 技 术 目 前 尚 未 完 善 ，但 一 旦 成 熟 ， 避 免 插 入 染 色 体 上 的 错 误 位 点 ，基 因 置 换 和 基 因 修 复 的 疗 法 将 在 治 疗 许 多 疾 病 时 取 代 基 因 添 加 疗 法 。 

    基 因 疗 法 的 发 展 激 起 了 大 量 的 道 德 争 议 ，争 论 的 焦 点 在 于 是 否 能 将 实 验 扩 展 到 胚 胎 和 胎 儿 细 胞 以 及 生 殖 细 胞 。有 些 致 命 的 和 致 终 生 残 疾 的 单 基 因 突 变 遗 传 病 ，在 出 生 之 前 或 出 生 后 不 久 就 表 现 出 症 状 ，例 如 囊 性 纤 维 病 变 。这 一 类 疾 病 的 治 疗 在 胎 儿 期 远 比 在 儿 童 期 有 效 。在 基 因 剔 除 的 转 基 因 小 鼠 模 型 中 使 用 in utero 疗 法 治 疗 相 应 疾 病 已 取 得 满 意 疗 效。人 类 的 in utero 和 生 殖 细 胞 基 因 疗 法 在 几 年 内 仍 将 被 禁 止 。 

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