植物重组疫苗

植物重组疫苗

许金飞

1. 植物重组疫苗的研究进展
    利用转基因植物生产基因工程疫苗是当前的一大热点，至今已获得成功的有乙型肝炎表面抗原（HBsAg）、不耐热的肠毒素B亚单位（LT-B）、链球菌属突变株表面蛋白（spaA）等十多种疫苗，用转基因植物生产的疫苗保持了重组蛋白的理化特性和生物活性，有的需要提纯后作疫苗，有的不经提纯就能作为一种食品疫苗（food vaccine）口服使用。这些重组蛋白可长期贮存于 种子中，便于疫苗的运输和推广。因此转基因植物作为廉价的疫苗生产系统，它有可能代替发酵系统生产疫苗产品[1]。

2. 植物重组疫苗的表达
    目前用作疫苗生产的基因表达系统有三种：第一，稳定的整合表达系统即外源基因稳定地整合在基因组上，列如根癌农杆菌介导外源DNA或直接导入。其优越性在于：通过无性繁殖或有性繁殖可获得大量转基因植物的后代，并且能够产生多基因复合疫苗产品，使用稳定的基因组整合技术转化植物细胞，现以获得转基因马铃薯、烟草和番茄。

    Curtiss等首次报道了使用植物报道系统生产口服疫苗（oral vaccine）,他们将链球菌属的一个表面蛋白（spaA）转入烟草获得表达，它在叶片中占总蛋白的0.02％。Mason等将HBsAg基因转入烟草获得了转基因植株，转基因烟草的HBsAg 表达水平为总可溶蛋白的0.01％，从转基因 烟草的叶子中提取的HBsAg组成平均为22nm的颗粒，其浮力密度和免疫原性与人和酵母来源的HBsAg都相似，这表明在植物体系中成功地保持了蛋白质折叠的特性。以重组HBsAg粗提液免疫小鼠，其免疫反应与商品化的HBsAg疫苗相似，产生了IgM和所有的IgG亚基，并使T细胞增殖，这表明转基因植物表达的抗原保持了激发B细胞和T细胞免疫反应的抗原决定簇[2]。LT－B也在转基因植物中得到了表达，由于微体保留序列与LT－B基因连接表达，细胞产生的重组LT－B隔离在微体囊泡上，电泳渗透层析和结合神经节苷脂分析表明，烟草来源的重组LT－B只有部分形成五聚体。小鼠口服实验表明烟草来源的LT－B能刺激小鼠产生体液和粘膜免疫反应，它诱导的抗体能中和LT的活性。此外，用LT－B的转基因马铃薯饲养小鼠，每次食5克块茎样品，四次后小鼠也产生了粘膜和抗血清抗体。狂犬病病毒糖蛋白在番茄中也获得了表达，PCR和RNA印迹分析证实了转基因番茄的也和果实中产生了正确的DNA分子，用蛋白质印迹检测到了糖蛋白的存在，通过免疫金标记的叶片组织的电镜观察和狂犬病病毒糖蛋白的特异抗血清实验表明，糖蛋白主要定位在高尔基体、囊泡、胞质膜和叶片维管束薄壁组织细胞的细胞壁。

    第二，瞬时表达系统即以病毒为载体的表达系统，但由于每个寄主植株都要接种病毒载体，所以瞬时表达不易起始，但能获得高产量的的外源蛋白质。利用病毒载体感染植物的瞬时表达也有一些成功的报道[3]，Turpen等将带有疟疾孢子虫抗原决定簇的多肽片段，插入到烟草花叶病毒（TMV）的外壳蛋白内部或与其C－末端连接，经感染的烟草都产生了高滴定度的稳定的重组病毒。通过酶标免疫和蛋白质印迹分析，重组外壳蛋白能够被单克隆抗疟疾抗体正确识别。最近，用豇豆花叶病毒（CPMV）建立了表达系统，CPMV具有高产。热稳定性和病毒易于纯化的特点，它是一个由60个拷贝的大小两种衣被蛋白亚基组成的二十面体颗粒。早期研究表明，口蹄疫病毒的抗原决定簇与大亚基融合后进行表达，但插入的RNA在一系列的继代传种过程中易引起丢失。而其经修饰的嵌合体可产生遗传稳定的融合，该系统已用于产生人鼻病毒14和人免疫缺陷病毒（HIV）的抗原决定簇，HIV的抗原决定簇产生的抗体能中和三种不同的HIV－I株系。

    第三，叶绿体转化。1988年，Boynton等首次成功地用野生型的叶绿体DNA转化了单细胞生物衣藻的突变体。证明植物叶绿体基因组是可以转化的[4]。以后一系列的研究结果表明，外源基因可以在叶绿体中得到稳定表达。而且，叶绿体作为外源基因转化的受体又具有诸多优越性：（1）便于外源基因定位整合；（2）基因为多拷贝，表达量高；（3）导入的外源基因性状稳定性高、安全性好；（4）能直接表达原核基因。1995年，Maliga实验室将Bt毒蛋白基因和启动子Prrn的嵌合基因导入到烟草叶绿体中，得到毒蛋白占可溶性蛋白的3～5％的高效表达，显示出植物叶绿体表达外源基因的优越性[5]。1996年，中国农业科学院生物技术中心沈桂芳实验室，将丙型肝炎病毒抗原基因NS3－C和CE1各自插入烟草、衣藻叶绿体转化载体中，获得了表达[6]。免疫实验尚在研究之中。

    利用稳定的基因组整合技术，人们建立了几个成功的植物生产疫苗的基因表达系统。烟草是转基因植物研究的模式植物，对它的遗传性状了解较多，烟草作为外源基因表达的受体已有很多报道如HBsAg基因、LT－B基因和spaA基因等都得到了成功表达。实验证明烟草作为外源基因表达系统所表达的重组蛋白能够正确装配，并且具有特定的生物活性，但烟草含有尼古丁等一些有害人体健康的生物碱，这增加了重组蛋白纯化的难度。马铃薯是研究较多的又一种转基因植物，但以马铃薯作为口服疫苗的生产也有不利的一面，马铃薯不宜生食，而加热可使马铃薯治疗大概重组蛋白变性，造成疫苗失活或活性降低。转基因番茄可表达狂犬病病毒糖蛋白，但其生物活性的详细分析未见报道。针对疫苗的生产，有人瞄准了香蕉，它是世界上排列为第四的重要水果，用GUS基因已初步证明了外源基因能够在香蕉中表达[70]。

3. 转基因植物生产疫苗的优缺点
    能够生产重组疫苗的其它系统包括：动物病毒（痘苗病毒、鸡痘腺病毒、逆转录病毒等）、细菌（大肠杆菌和枯草芽孢杆菌）、酵母（ 酿酒酵母）、昆虫细胞和哺乳动物细胞。然而，它们都存在弊端，限制了其商业化应用。例如：细菌细胞不能完成许多病毒蛋白质的转录后修饰作用，不利于蛋白制的重新折叠，导致其免疫性通常较弱；酵母菌对有些蛋白质的过分糖基化可能影响针对特定蛋白质的免疫反应，防碍了酵母菌在一些疫苗生产中的应用；多数动物培养系统表达水平低、需要昂贵的生长培养基，并且培养基需特殊处理，以消除致病的有害微生物，因此，疫苗成本很高。

    转基因植物疫苗则具有它们无法比拟的优越性：（1）易于形成产业化规模，在筛选到高效表达植株后，只需增加耕种面积就能扩大其生产量；（2）价格便宜，因为植物易于栽培和管理；（3）安全，植物病毒不会感染家畜及人类；（4）使用方便。已有的实验表明，多种转基因植物疫苗都可以采取口服的方式接种，因此更易被人们接受。当然，转基因植物疫苗也存在一些有待克服的不足。首先，从植物细胞中提纯特定的蛋白并非易事；其次，有些转基因植物疫苗的有效成分含量较低，接种这种疫苗不但不会诱发机体的保护性免疫反应，相反会免疫耐受；此外，如果以直接食用转基因植物的方式进行预防接种，还会遇到进一步的问题。

4. 参考文献:
1. Moffat AS. Science 1995, 268:658.
2. Thanavala Y et al. Proc Natl Acad Sci USA 1995, 92:3358.
3. Turpen HT et al. Proc Natl Acad Sci USA, 1995, 92: 3358.
4. Boynton JE et al. Sience 1988, 240: 1534-1538.
5. Mcbride KE et al. Bio/Technology 1995, 13(4): 362-365.
6. 范国昌等， 浙江大学学报，1998。