分子农业

分子农业

许金飞

    在过去十多年中， 植物分子生物学领域的研究取得了巨大的成就，同时，又由于植物遗传分析和遗传工程技术的革新，使转基因植物不仅在基础研究上，而且在生产实践上都具有重要意义。其中植物能够整合、表达外源基因，用极低的费用大量生产重组蛋白，这具有极大的商业价值。

    到目前为止, 能够表达外源基因的植物品种有很多, 但用生物反应器来研究、生产重组蛋白的植物种类并不多, 主要有烟草、马铃薯、拟南芥、西红柿等。其中烟草是最适合作为“生物加工厂”来生产高价重组蛋白的植物，这是由于：（1）烟草容易进行遗传工程操作，在植物分子生物学的研究领域，烟草作为一种实验工具有“白鼠”之称；（2）快速繁殖能力，从最初叶片材料的转化开始，仅需2至3个月就可获得F0代转基因植株，一个烟草植株就能产生上百万的烟草种子很方便进行大规模生物生产；（3）产量高，高密度种埴可以使烟草叶的产量达70,000Kg fresh weight/acre， 这完全能满足转基因蛋白的批量生产。

    利用植物表达体系, 人们已成功地表达了多种重组蛋白。除了抗体和一些疫苗已经在转基因植物内成功表达外，其它在植物体内成功表达的脊椎动物蛋白有：人血清白蛋白[1]、人a－干扰素[2][3]、人促红细胞生成素（EPO）[4]、Leu-enkephalin[5]、兔肝细胞色素P－450、仓鼠3－羟基－3－甲基戊二酰CoA还原酶。概括起来这些重组蛋白可分为三类: 第一类是抗体（包括单克隆抗体）; 第二类是药用蛋白（包括酶） 最早用植物成功表达的药用蛋白是神经肽, 这是1989年比利时PGS公司的科学家首次找到的药用蛋白生产新途径, 之后相继出现了用植物生产药用蛋白的热点； 第三类是疫苗,美国Boyce Thompson 研究所的Arntzen博士等已开始研究利用转化美味植物（可在原始状态食用的水果蔬菜）生产那些可刺激产生粘膜免疫反应的疫苗, 最近他们已成功地培育成表达HBsAg（ 肝表面抗原）和LT-B（大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位）的转基因香蕉, 并正在进行临床试验。由此看来, 用植物作为表达系统研究和生产各种自然界存在量少而药用价值高的各种蛋白不仅是可行的, 而且具有重要意义。

    国内在植物表达系统上的研究起步较晚, 根据报导, 目前仅有两个单位在进行这方面的研究, 一个是中国科学院微生物研究所植物生物技术开发实验室正在进行植物表达系统的研究, 试图开发药物生产新途径。他们研究室正在采取将病毒载体转化植物的策略，构建一种以黄瓜花叶病毒（CMV）为基础的新型植物表达系统。其基本原理为：将编码CMV RNA复制酶的CMV RNA1和RNA2的cDNA转化植物，在整个植物体内一个CMV RNA的复制系统，并以此作为受体植物；以目的基因取代位于CMV RNA3的3’端区域的CP基因表达subgenomic启动子的指导下在植物体内获得高表达，此外，他们也对以烟草花叶病毒（TMV）为基础的表达载体进行了研究。 另外一个是中国科学院遗传研究所正在进行在植物中表达抗体方面的研究。他们主要进行了两个方面的研究：第一方面，首先以抗乙型脑炎重链可变区（VH）基因为目的基因，并对常用的植物载体pBI121加以改造，建成含有35s启动子启动VH基因的融合基因质粒pZETB10。用基因枪法将该质粒转入烟草。从转基因植株中提取蛋白，用检测乙脑病毒的检测试剂盒测试活性。结果表明植物产生的VH有较强的抗原结合特性。第二方面，他们研究了抗甜菜坏死黄脉病毒（BNYVV）的scFV用于抗病育种的可能性。

    近年来，用培养的植物细胞来大量生产昂贵的蛋白已经受到广泛关注。当表达的目的蛋白需要经过复杂的翻译后加工时，用培养的植物细胞来表达是非常合适的，因为这种蛋白不能被重组微生物系统完成，而用动物培养细胞则价钱太昂贵。用转基因植株来生产识别需要栽培、收获、抽提，用植物培养细胞能提供一个廉价的表达系统。

    转基因植物表达系统除了用来生产重组蛋白外，还被用来解决农业问题。植物转基因技术最经常的应用是表达有抗性的外源蛋白使植物获得抗病、抗虫能力，用转基因使植物获得抗病、抗虫有许多途径，包括各种各样自然界本身存在的抗性蛋白，和最近的利用合成的抗性基因。

    除了普通的通过表达病毒衣壳（CP）蛋白使植物获得抗性外，一些其它的可翻译的病毒序列也被用来作为抗病基因[1][2]。另外的方法是利用转基因植物表达自然界本身存在的抗病基因，当天花粉毒蛋白Trichosanthin（一种从中草药Trichosanthes kirilowii来源的核糖体失活蛋白RIP）在转基因烟草叶片中占总可溶性蛋白的0.1%时，植物完全抗TMV。用从非洲cassava mosaic virus来源的病毒敏感的启动子对RIPdianthin进行诱导表达，以避免RIP在转基因植物内的组成表达所带来的毒性影响。当用非洲cassaca mosaic virus接种时转基因烟草（Nicotiana benthamiana）表现出了弱的病毒感染症状[3]。单独人的抗病毒RNA－decay-pathway enzymes 2-5A合成酶或者RNaseL表达不足以使转基因植物具有抗性，但是用RNaseL在转基因植物叶片中的激活实验表明：两个酶对抗病毒活性是必须的[4]。

    转基因植物对抗真菌的抗性可以通过组成型表达能够水解真菌细胞壁的酶，如几丁质酶、b－1，3－葡糖苷酶，或者是两者同时转化。Mirabilis jalapa 和Amaranthus caudatus 来源的富含Cys的抗微生物多肽在体外是具有抗菌功能的，但它在转基因烟草中表达并不能使转基因植物获得抗性[5]。使多肽定向地胞内表达也未减弱植物抗病的症状，这个抗真菌多肽在植物体内的抗性的失效可能的解释是它的低的表达水平，或者是富含二硫键的多肽对环境中的离子强度是敏感的。

    用转基因技术使经济植物获得抗虫能力的方法有多种。豇豆胰蛋白酶抑制剂的组成型表达使转基因水稻抗yellow stem borer Scirpophage incertulas 和the striped stem borer chiio suppressalis（这是亚洲水稻的两种主要昆虫）[6]。表达了雪花莲凝聚素或胰蛋白酶抑制剂的土豆，tomato moth不喜欢食。菜豆几丁质酶是不足以使植物具有抗性[7]。自八十年代后期以来，Bt毒蛋白被广泛用来转化植物。但由于植物和细菌的偏爱密码子不一样，许多情况下，其表达量太低，不足以使植物具有抗性。毒蛋白基因的修饰，列如：富含A＋T序列的去掉，可能引起mRNA的 不稳定或异常剪切。修改偏爱密码子 使其更相似于宿主植物，或者平切编码序列以提高毒蛋白表达水平。这样，更近来的方法是利用被修饰的合成的晶体毒素基因以更有效地在水稻[8]、Canola[9]、大豆[10]、苜蓿和烟草[11]中表达。

    培养的植物细胞能够把目标蛋白分泌到胞外，一方面不影响细胞的正常生长，另一方面也能获得高产量。植物细胞培养条件对重组蛋白的产生也会产生很大的影响，列如：通过增加蛋白稳定剂聚乙烯吡咯烷酮至培养基，分泌型的鼠单克隆抗体重链的表达量提高了35倍，其在转基因烟草的悬浮培养液中达到0.36ug/ml；用高密度发酵罐，Auchusa officinalis细胞培养能产生27.2g/l干重的细胞密度和1.1g/l的总胞外蛋白浓度，而不用时则只能产生12.6g/l的细胞干重和0.47g/l的胞外总蛋白。

    植物分子育种正在以惊人的速度向前发展，二十年前报道了第一列将外源DNA导入植物体内[12]；转基因产品也得到了充分的发展。至今，转移不同性状的转基因作物在美国被批准进入大田试验的作物有40种以上，包括小麦、玉米、水稻等四种禾谷类粮食作物，主要的纤维作物棉花、10种以上的蔬菜、9种水果、还有油料作物、牧草和花卉等等。1996年底前已批准进入市场商品化至少有18种，还有一批有待批准。转基因植物管理上的考虑必须包括它们的遗传稳定性、重组蛋白的纯度，特别是它们作为人用或者是考虑对环境的影响时更应该是如此[13]。植物分子遗传学的技术事实上已经允许每一种植物品种转化和大量表达外源基因。由于这些新的技术，我们现在能够用转基因植物大量生产安全的、廉价的重组蛋白。

参考文献
1. Sijmons P, Dekker BMM et al. Bio/Technilogy 1990, 8: 217-221.
2. Dezoeten GA, Penswick JR. Virology 1989, 172: 213-222.
3. Zhu ZKW, Hughes L et al. Plant Cell Tis Org Cult. 1994, 36: 197-204.
4. Matsumoto SK, Ikura M et al. Plant Mol Biol. 1994, 27: 1163-1172.
5. Bandekerckhove J, Damme JV et al. Bio/Technology 1989, 7: 929-932
6. Lomonossoff GP, Annu Rev Phytopathol 1995, 33: 323-343.
7.Dawson WO, Trends Plant Sci 1996, 1: 107-108.
8. LamYH, Wong YS et al. Plant Sci 1996, 114: 111-117.
9. Sengupta Dn, Sengupta Bet al. J Plant Biochem Biotech 1996, 1:69-74.
10. De Bolle MFC, Osbom RW et al. Plant Mol Biol 1996, 2: 167-173.
11. Xu DP, Xue OZ et al. Mol Breed 1996, 2:167-173.
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13. Wunn J, Klori A et al. Technology 1996, 14:171-176.
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