蛋白质结构转换和构象病

蛋白质结构转换和构象病

作者    张宇

    蛋白质生物功能的发挥是以蛋白质的空间结构作为基础的，因此,蛋白质在生物体内所担负的复杂的生化反应，也需要相对应的空间结构来体现。如果构象发生变化，则会导致生物功能的异常，蛋白质失活甚至产生疾病。近年来，由于某些蛋白质结构转换和错误折叠而引起的“构象病”的发现，促进了蛋白质构象变化与生物功能关系研究的热潮。 
    

    那么，如何对这些构象病进行研究呢？一条途径是找到这一类疾病的整体特征，即从引起各种疾病的蛋白的结构变化中找到规律。由于这些构象病的形式差异极大，看上去很难找到什么共同的规律，但实际上，这些构象病都具有非常一致的特征，即构象变化最终会导致蛋白积聚,而这些积聚多与β折叠结构有关。在下面的文章中会具体讲述这一点。另外一条途径就是寻找一些构象病的典型例子，其分子机制比较容易或已经较好的被阐明了。在这方面，丝氨酸蛋白酶抑制剂家族（serpin : serine proteinase inhibitors)为我们提供了一个较好的例 子。

构象变化产生淀粉样化蛋白

    在构象病的结构学研究中发现，由于相应蛋白的异常构象转换引起的不同的构象病，都具有导致蛋白质积聚及组织沉积的特征。现在已经注意到，这种异常蛋白质构象变化引起的组织沉积的一个明显后果就是产生排列有序的淀粉样化纤维。多种事实证明，蛋白质结构变化引起的疾病，如家族性淀粉样变性多神经病（FAP，family amyloid polyneuropathy），老年性痴呆症（AD,Alzheimei’s disease） 等都与 淀粉样纤维沉积有关，具体原因可能是由于所形成纤维的神经毒性或与干扰了组织的生理功能有关。现在已知，这种纤维的形成是以一种特征性的交联的βSheet结构有序排列，且β结构的每一条链与纤维的长轴垂直。

    可产生淀粉样化的蛋白质在结构上和序列上并无同源性，但从X-射线衍射的结果来看，它们都能形成具有相似结构的淀粉样纤维。同时，这些淀粉样化的蛋白质也都能与刚果红染料结合而产生绿色的双折射光。这些现象都说明了淀粉样化的蛋白不是在正常折叠水平上形成的。这些蛋白的共同之处正在于它们都能发生结构转换，在细胞内特定条件下变为一种可产生淀粉样化的构象，从而可自我组装成为淀粉样蛋白。由此可见，构象转换在淀粉样化形成并导致疾病中的重要性，我们也可以这么说，构象转换是形成淀粉样化的决定因子。1991年，纯化的甲状腺素运输蛋白（TTR，transthyretin)在模拟溶酶体PH的酸性变性条件下，发生了构象转换，产生了形成淀粉样化的中间体并自我组装成淀粉样纤维。 
    

    这个实验就直接证明了，构象变化本身就足够产生淀粉样化的中间体，从而改变了原来认为蛋白酶解是形成淀粉样化的决定因子的看法。近年来，一系列的可产生淀粉样化的蛋白，如TTR突变体，免疫球蛋白轻链，溶菌酶等，也都被发现它们的正常折叠蛋白经诱导构象变化后可转变成为淀粉样蛋白，这都支持了这种说法。由此可以得到构象变换的假说(The comformational change hypothesis )，也就是特定 变性条件下三级结构的变化可以使某些具正常功能的可溶性蛋白形成可淀粉样化的中间体，发生自我积聚并产生淀粉样纤维。我们就以 TTR为例来看看形成淀粉样化的构象变换学说吧。

    TTR是体内的一种甲状腺素运输蛋白，它可直接结合并转运甲状腺素，同时，它也可通过与视黄醇结合蛋白的结合而间接转运视黄醇。它的野生型和突变型的蛋白的沉积可以引起不同的淀粉样化疾病，而这些疾病与TTR的生物功能似乎并无联系。野生型的蛋白在脑中所形成的纤维沉积会引起老年系统性淀粉状蛋白病（senile systemic amyloidosis)，发病年龄大约在80岁左右。而一种TTR的突变体的淀粉样的沉积则会造成一些外周神经疾病和组织功能障碍，这些疾病通常被称为家族性淀粉样变性多神经病，即FAP，它的发病时间较早。研究表明，在酸性条件下，TTR正常折叠的四聚体会解聚成为单体的形成淀粉样化的中间体，这种中间体的三级结构发生了改变，而且它可以导致淀粉样纤维的形成。一系列的荧光实验和圆二色性实验都证明：通过结构重排而产生的TTR中间体具有较正常折叠结构不同的富含β折叠的三级结构。同时，通过生物物理的研究显示，对于与FAP相关的 TTR突变体如V30M和L55P而言，PH5条件下，它们的四聚体－单体的平衡比野生型TTR的平衡中单体的比例要大得多，这也就证明了突变体在变性条件下结构趋于不稳定，更易于形成向淀粉样化转变的中间体。这种酸性诱导的部分变性而导致的结构上的不稳定与发病年龄有着密切的关系。随着野生型TTR，V30M TTR，L55P TTR 的结构不 稳定性增加，相应的发病年龄迅速减少，分别为80岁，30岁和20岁。由此，蛋白淀粉样化疾病的发生确实与相应蛋白的构象变化有着密切的关系。

淀粉样化纤维形成的多步自我组装途径

    与FAP相关的突变体较野生型TTR更易变性形成淀粉样化的中间体，那么，这种中间体又是如何形成淀粉样纤维的呢？原来认为淀粉样化的中间体自我组装成为淀粉样纤维的机制是一种有核的聚和机制。单体的中间体首先形成具特定四级结构的核，然后，单体迅速加在核上，形成纤维状结构。这一过程的发生是非常迅速的，溶液中仅发现单体和淀粉样纤维的存在。但在老年痴呆症的淀粉样纤维A－β的组装研究中发现，这一过程并不这么简单，它还包括了一些更复杂四级结构的组装过程，是一个多步的组装过程。

    A－β是形成Alzheimer’s病纤维的蛋白的40－43残基。A－β与TTR相似，在形成淀粉样纤维时，都会产生四级结构的中间体。但在Holzman等的研究中发现，在磷酸缓冲盐溶液PBS中，A－β的可溶性单体的自我组装可以产生几种不同的中间体种类，包括一种沉降系数为50000S的大的积聚体和一种沉降系数为30S的较小的积聚体。也就是说，至少有两种四级结构的中间体在纤维形成的过程中产生并最后消失。而且可以推测，这一过程可能形成了原纤维，原纤维再进一步形成最后的纤维结构。但是，这些推测的过程都还需进一步的实验来证实，目前在免疫球蛋白轻链中的发现为这一过程的研究提供了一种有用的新思路。D82I是免疫球蛋白轻链中的一个突变，它可以降低蛋白的稳定性，并形成可完全组装的中间体，但这种中间体的组装在表型上完全不同于淀粉样纤维。弄清这种突变如何控制非淀粉样化的组装无疑对我们弄清淀粉样纤维的组装是非常有益的。

    淀粉样化的确是构象变化产生的一个最终后果，它可以解释一些疾病的病理现象和组织损伤，但是，单纯的将注意力集中在淀粉样化上是远远不够的，它只是结构上不稳定造成的后果之一。已有证据表明，在prion和老年痴呆症中形成的淀粉样蛋白斑并不是引起疾病的直接原因，而只是一种伴随现象。

蛋白质结构转换引起构象病的范例：Serpin

    异常的构象引起的构象病的途径是多样的，serpin家族为我们提供了一个了解这些途径的很好的范例。目前，完整的serpin的十来种不同构象形式的晶体结构已经得到，从中发现了一些蛋白质折叠上的可变性造成的异常构象变化，而这些变化是与serpin的抑制机制最相关的。

    Serpin的活性中心是一段16残基的Loop区域,这一段区域是同源的蛋白酶所共有的。在蛋白酶的活性形式( active form)中，包含了一个五 链的β折叠片层，且这一段Loop区是暴露在外的。如果将活性中心切开，则会造成loop区肽段插入蛋白的β折叠片层中，形成六链的β折叠片层，从而使活性部位有关的残基被包埋而导致活性丧失。这种活性中心的改变，使整个分子从一个亚稳态的有活性的抑制剂变成了高度稳定的裂解型,称为Cleaved form。从亚稳态到高度稳定的改变造成了 能量上的巨大变化，能量上的变化致使天然的未裂解的serpins也容易发生异常的构象变化，使完整的活性Loop区转变成为β折叠链插入折叠片层中，形成无活性的潜伏型，即Latent form。

    随着结构改变会产生另一种变化，就是会产生分子间的连接，形成二聚体，寡聚体和多聚体。活性中心的Loop可以插入另一个分子的β折叠片层区，从而形成了Loop－Sheet的多聚体。血浆中的弹性蛋白酶抑制剂α－抗胰蛋白酶的遗传突变型就是一个好的例子。在欧洲的一些家系中，找到了一些抗胰蛋白酶的构象不稳定的突变型，这些突变型中，活性中心的Loop区易于形成β折叠的构象，插入另一分子的开放的折叠片层中，形成Loop－Sheet的多聚体。在体内和体外实验中，都找到了这种长链多聚体的存在。而在体内，肝细胞中α－抗胰蛋白酶的这种多聚体的长期积累可以引起肝硬变的发生，同时，由于血浆中缺乏正常的α－抗胰蛋白酶，会使肺中的弹性组织失去保护，同样经过多年的积累后会导致肺损伤性疾病肺气肿的发生。由此我们可以看到，单个的结构变化机制就会导致多种临床上的反应，而且，蛋白聚集造成的组织积聚的长期积累最终会导致某种疾病的发生。抗胰蛋白酶为我们提供了蛋白构象病的产生途径的一种例子。

    另外，对serpin家族的其他成员的研究发现，活性Loop区作为分子间连接而形成多聚物的方式是多样的,如在血纤蛋白溶酶原激活物抑制剂（plasminogen activator inhibitor, PAI ) －1 中就发现， 蛋白的 β－ 折叠片层就形成了一个七链折叠的结构。因此，即使是对同一类蛋白引起的已经了解的比较清楚的疾病，也不能断言它的结构机制是完全一致的。这正体现了构象病发生机制的多样性。

构象不稳定导致构象变化的发生

    我们现在知道，构象变化可以引起相应的疾病，但是，这种构象变化又是由什么因素引发的呢？Serpin的功能障碍的研究表明：单个的降低稳定性的突变就可以产生构象转化的结果。Serpin的残基侧链上由于突变而发生微小变化，就可使它的β－Sheet结构稳定性发生变化，使折叠片层变的易于开放并可接受其他链。同样，通过随机突变，我们也可找到一些使蛋白结构更稳定的突变，进行研究。

    在抗凝血酶的研究中，就找到了这样一些突变体。如果抗凝血酶中发生了单体的构象变化，从有活力的分子变为潜伏型，则会使抗凝血酶失活，并造成血栓形成。目前，找到了具有这样疾病的两个家族，每个家族都具有同一个保守的苏氨酸的突变，这个位点的突变造成了有活力蛋白的折叠片层区域的开放。由此可见这个苏氨酸对于分子的稳定性是极为重要的，如果用丙氨酸取代苏氨酸，它会使β折叠区关闭，从而使分子高度稳定。而在具易形成血栓疾病的其中一个家族中，发现这个苏氨酸被赖氨酸所取代。当人的体温由于发烧而升高时，这个家族的病人的血栓形成情况就更加严重。但进一步研究发现，在这个家族的病人的血浆中，异常蛋白质的含量非常少。这为构象病的发病机制提供了另一种可能性，也就是结构上的不稳定会导致新生肽链的错误折叠，因而导致蛋白表达和分泌的减少。在另一个家族中，苏氨酸是被蛋氨酸取代的，蛋氨酸对结构的影响较小，因此这一家族中形成血栓的情况要好得多，只有当另一些影响血液凝固的蛋白同时发生突变时才会造成疾病的发生。对该家族的从血浆中分离的抗凝血酶突变蛋白的研究发现，一些突变体已经发生了构象变化，形成潜伏型，而其余的蛋白在温度稍有增加时便会发生构象变化。由上面的几个例子可以很清楚的看出，不同稳定性蛋白转变成无活性的潜伏型的程度和速度是有很大差异的。对正常的抗凝血酶而言，构象转换有发生但极为缓慢，这对应着人体的正常衰老过程。对于T85M突变体而言，转换发生比较慢，它需要与其他诱因一起造成血栓形成。而T85K突变体由于结构上的极不稳定，它的转换则比较快，而当体温升高情况下，结构转换更快，并相应导致了血栓的大量形成。

    Serpin家族为我们提供了结构上的异常而引起的不同疾病后果的模型，如α－抗胰蛋白酶形成长链的多聚体以及抗凝血酶的单体结构变化造成功能失活等。除此之外，serpin家族也对其他构象病如老年痴呆症，prion引起的海绵状脑病等的机制的可能性提供了一个参考评价体系。

治疗前景

    既然这些构象病具有相似的特征，那么由此出发，就可以寻找一些治疗途径。Sunder等就指出了可用于治疗的两类分子：一种是可以干扰前体蛋白向β折叠结构转变过程的物质，另一种则是阻止原纤维向淀粉样纤维转变或使这一过程反转的分子。

    同样是在对serpin的研究中，我们找到了一些有这样功能的分子，它们可以通过与蛋白的结合而阻止蛋白的折叠情况发生变化，从而阻止了蛋白积聚的发生。也就是说，其他分子的结合可以稳定蛋白的天然构象。如在体内，serpin家族中的PAI－1的自发的构象变化就可以通过与玻连蛋白（vitronectin)的结合而被抑制。同样的，抗凝血酶与肝素结合后，就不易向潜伏型转变了。这些分子都是结合在蛋白三级结构上一些易发生显著的结构重排的位点上，但是，这些位点不一定就是位于β折叠片层区域，也可能是折叠旁侧的一些区域，如一些螺旋上等。Serpin家族中找到的这些位点对于其他构象病中的淀粉样纤维的形成可能也是必需的，那么，使用一些可与这些位点结合的类似的阴离子物质为其他构象病也提供了一种可能的治疗方法。目前，小的肝素寡糖分子已为抗凝血酶的结构转变引起的疾病的治疗提供了一条较为可行的治疗途径。肝素一方面可通过与抗凝血酶单体上一些螺旋的结合稳定五链折叠的活性形式，从而防止折叠片层区的开放，另一方面也可阻止分子间的连接及多聚体的形成。


    对于各种不同的构象疾病来说，作为一个整体来进行研究似乎是不必要的，因为从表面上看，蛋白淀粉样化和家族性凝血是完全不同的两种疾病。但从内在机制来看，这些疾病由有它们的共同之处，那就是相应蛋白结构上的不稳定，并产生一些病理后果，如蛋白的错误折叠导致表达减少，蛋白的结构转换导致功能丧失等，或者蛋白质积聚产生淀粉样沉积，在这一过程中可以形成一系列的中间体和原纤维等，这些中间形式都可能与相应的疾病的发生有关。对这些构象病的共同机制的研究为阻止这些疾病的发生提供了一些共同的治疗前景。




参考文献
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