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控制蛋白质翻译质量的mRNA监视
【字体： 大 中 小 】 时间：2000年07月25日 来源：
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控制蛋白质翻译质量的mRNA监视
作者 张宇
在真核细胞中,基因的表达通常是由DNA到RNA再到蛋白质的。在这 一过程中，为了确保产生正确的蛋白产物，需要一系列的保证措施。一方面，细胞的基因表达的蛋白机器是极其精妙的。在“基因表达工厂”中包括了一些分别负责转录，剪切，mRNA加工，转运，翻译等过程的“部门 ”。这些“部门”相互联系，共同作用产生错误率极低的蛋白产物。而另一方面，细胞内还存在一些防止错误产物产生的机制，称为质量控制机制 (Quality control mechanisms)。近几年来，我们发现了一种保守的mRNA降 解系统，它存在于真核细胞内用于降解异常的mRNA，这种机制被称为 mRNA监视 (mRNA surveillance)。这正是质量控制的一个方面。
细胞内的mRNA监视是指细胞通过监视转录过程，将异常的mRNA与正常的mRNA区分开来,并将异常的mRNA迅速降解的过程。异常的mRNA通常是在蛋白的编码区包含了无义突变，因而会产生较正常蛋白短的翻译产物。它可由两种不同的途径产生。一是由于DNA的突变产生异常的转录产物，如DNA发生碱基替换使有意义的密码子变为三种终止密码子中的一种，或由于移码突变产生终止子等。另一条途径是在前体mRNA的加工过程中发生异常,如酵母的CYH2的前体mRNA由于不完全剪切,保留了一个内含子，这个内含子中就有一个使翻译提前中止的密码子，这个转录产物就会被mRNA监视系统降解。
由于被这种机制所降解的大部分转录产物均包含翻译提前终止的密码子，即无义密码子，因而mRNA监视通常称为无意义介导的衰变(nonsense-mediated decay，NMD)。
现在已知，NMD途径在所有的真核细胞中都可发挥功能，如真菌,植物，脊椎动物中等，它确保了蛋白的翻译在正确的终止密码子处终止。由于包含了使翻译提前终止的无义密码子的转录产物被迅速降解，这就阻止了不完全并可能具有潜在危害的蛋白的表达，这正是生物体除去影响细胞功能的错误的基因产物，保护自身机体的正常运作的一种途径。
NMD途径与正常的mRNA衰变途径
在酿酒酵母中，正常mRNA衰变的速率是取决于它的3’端的polyA尾巴的移去和5’端的脱帽速率的。当polyA的尾巴缩短到一定程度，它就不能与polyA结合蛋白（如Pab1p)保持相互作用。一旦polyA短到它的结合蛋白不能结合时，mRNA衰变就被引发，核酸酶Dcp1p会作用于它的5’端使之脱帽,而5’到3’的核酸外切酶Xrn1p则会从它的5’端开始消化mRNA。为什么polyA的尾巴可以引发这一过程呢？在持续翻译过程中，polyA的尾巴会通过Pab1p和转录起始因子eIF-4F的亚基eIF-4G与帽子结构作用，形成 闭合环状的形式。这种构象可以保护5’的帽子结构不被Dcp1p切掉，同时核糖体也可在环状的mRNA上启动持续的翻译。当polyA尾巴移走后，这种 环状构象被破坏，5’端就因失去保护而被脱帽继而暴露出来，外切酶就将 mRNA降解了。
在NMD途径中，mRNA的降解与正常的mRNA衰变过程具有一些共同之处，在NMD中，无义的mRNA也会被Dcp1p脱帽，然后被Xrn1p从5’端开始消化。但与正常途径不同的是，这一过程发生时polyA的尾巴并未被移走。那么无义mRNA是如何在不考虑3’端状况情况下被迅速降解的呢？现在认为这一过程可能是在mRNA生命的早期起始NMD而引起的，这时造成持续翻译的闭合环状结构还没有完全形成，异常的转录产物就被降解了。但是，不能持续翻译并不意味着不需翻译，由脱帽引起的mRNA监视同样需要核糖体翻译mRNA的过程。这一点是已经由很多事实证明了的：一是正是无义密码子引发了mRNA衰变；二是抑制型tRNA的存在可减少或消除无义密码子对mRNA降解的作用；第三，通过在5’UTR区插入一个茎环结构或在起始密码子处突变阻止翻译的发生可以稳定无义的mRNA；第四， NMD系统的一些组分以及无义的转录产物都可与多聚核糖体共同分离，证实了它们之间的相互作用。这些事实都提出了一个问题，那就是在翻译过程中正常的和异常的转录产物如何被区分开来的，也可以说，细胞是如何区分正常的和使翻译提前终止的终止密码子的？这正是决定NMD途径如何降解异常转录产物的关键。
区分正常与异常终止密码子的顺式作用因子：DSE
由于细胞中只有三种终止密码子（UAA，UAG和UGA），因此，它们很难携带足够的信息来区分正常的和翻译提前终止的过程。研究显示，无义密码子是通过它的3’的序列来显示其异常的。这段序列被定义为downs-tream element ( DSE)。如果转录产物包含了一个无义密码子，但却缺少一段 DSE的存在，它就不会被NMD途径降解。这样，引起NMD的信号就是由一个无义密码子和它3’的DSE共同组成的。
在酵母中，对于DSE与无义密码子的相互作用的研究已经较为清楚了。这些研究表明：DSE仅在至少一次翻译过程完成之后才发生作用，但在翻译过程中起作用的是起始和终止过程，翻译的延伸过程并不是必需的。这与NMD需要翻译来诱导的事实是一致的。另外，DSE位于终止密码子的 3’端150nts的范围内就可与发挥作用，它并不需要紧邻无义密码子。
在mRNA监视过程中，DSE的识别无疑是一个关键步骤。是由什么因子来完成它的识别目前还不是特别清楚，但现在所找到的一种专一识别并结合DSE的RNA结合蛋白Hrp1p可能会给我们一些启示，在后面的部分会详细谈到这一点。
目前同样发现，RNA的序列在影响判断mRNA是否正常这一过程时，也有负面的影响，这就是使NMD失活的 stabilizer element (STE ) 。目前找 到了两种STE：一种是位于蛋白质的编码区，它必须被翻译后才可作用，另一种STE是GCN4的mRNA中uORF4下游的一段68nt的序列，当它位于一个提前终止密码子下游并在DSE的上游时，它可以保护mRNA不被mRNA监视机制降解。由此可知，至少有两种使NMD途径失活的机制。
在哺乳动物细胞，同样对NMD所需要的序列进行了研究。其结果与酵母细胞中是相似的，激活NMD同样需要无义密码子和一段下游序列的相互作用。有意思的是，尽管剪切后的转录产物是NMD的作用底物，但无义密码子3’端的内含子也可以起到DSE的作用。由于NMD是发生在细胞质中的过程，那么，在细胞核中就被移去的内含子是如何影响细胞质中的mRNA衰变过程的呢？目前有人认为，可能是剪切的过程在内含子的位置对异常 RNA进行了标记，而且这种标记可能就是剪切过程中与mRNA作用的蛋白。下面的部分将对此作进一步的描述。
NMD过程中发挥作用的反式作用蛋白：Upf
在NMD过程中，除了一些顺式作用序列外，还需要一些反式作用因子的作用。在酵母中，找到了这样三个蛋白：Upf1p，Upf2p，Upf3p。这三个因子的基因突变会使包含无义突变的mRNA的稳定性发生变化，但不影响野生型的mRNA的衰变速率。近来的研究显示，这三种因子在NMD中可能相互作用形成复合物，称为监视复合物( surveillance complex ) 。 三个 UPF 基因的同时缺失对NMD的影响是和单个的UPF基因的缺失的效果是相同的，这就证明了UPF蛋白是以复合物的形式发挥功能的。另外，在哺乳动物细胞中，现在也找到了UPF1的同源基因RENT1和HUPF1，这些基因的相应蛋白同Upf1p相似，都具有一个半胱氨酸的丰富区和一个ATP－螺旋酶结构域，只是在长度及末端序列上有所不同。在功能上，这些蛋白同样可在控制无义mRNA稳定性方面发生作用。这些都从一个侧面证明了NMD是一条进化保守的途径，从而为我们提出一个在酵母和高等动物细胞中的统一的模式提供了依据。
在酵母的这三种因子中，Upf1p是研究的最为清楚的一个因子。这个蛋白具有四种活性：ATP结合，依赖于ATP的核酸结合活性，依赖于核酸的ATP水解活性，依赖于核酸的5’端® 3’端的RNA/DNA螺旋酶活性。它的 异常可以引起无义mRNA的稳定性的变化。另外，除了它加速无义mRNA的衰变的作用外，现在也发现了它有加强无义密码子处的转录终止的作用。在UPF1基因中找到了一序列突变，它们分别具有影响mRNA衰变和调节无义密码子处的终止翻译的功能，这说明了Upf1p在这两方面均有作用。转录终止是蛋白质表达的最后一步，它是在终止密码子处发生，并使多肽链从核糖体上释放。真核细胞中，这个过程是在两个蛋白因子的控制下完成的：eRF1和eRF3。Upf1p被发现与这两个翻译释放因子均有相互作用。而且，eRF与Upf1p的结合阻止了Upf1p与RNA的结合，这种结合同时还抑制了 Upf1p的ATP酶和螺旋酶的活性，而这两种酶的活性经Upf1p的突变实验证实是Upf1p在mRNA衰变过程中发挥功能所必需的。这就意味着，Upf1p的终止翻译及促进NMD的两种功能不是一起发生的。
监视复合物中的其它两个因子Upf2p，Upf3p的缺失同样表现出了无义抑制的表型，即不能有效终止翻译，这证明它们也对翻译的终止有影响。以上这些都表明监视复合物对于有效的在无义密码子处的翻译终止同样是必需的，这就初步显示了在翻译终止和mRNA衰变两个过程中可能存在着一种内在联系。这可能是一个顺序发生的过程，监视复合物先保证了无义密码子处的有效终止，然后再引发异常转录产物的降解。目前，我们还没有发现Upf蛋白在正常终止密码子处翻译终止中的作用。
NMD机制在酵母细胞及哺乳动物细胞中的一种统一作用模式
我们现在已经了解了mRNA监视过程中涉及的顺式作用元件和反式作用因子，那么这一过程的具体机制又是如何呢？前面提到的Hrp1p为我们提供了一条线索。
现在发现Hrp1p是一种RNA结合蛋白，它可以识别DSE序列，并可以在细胞质和细胞核中穿梭，另外，它的突变会影响体内无义mRNA的稳定性，这就证明了它在NMD过程中具有一定的作用。因此，Hrp1p可能是在细胞核中和RNA结合，并一起转运到细胞质中，有DSE序列的异常的转录产物结合有Hrp1p，从而与正常的转录产物区分。而在高等动物细胞中，上面提到的需要一个内含子来激活NMD的现象也可由RNA结合蛋白来解释，剪切过程将一个RNA结合蛋白加到mRNA上，并随转录产物一起从细胞核转运到细胞质中，这个mRNA结合蛋白就可以看成是剪切造成的标记。它标记了异常的转录产物，并将之与正常的mRNA区分开来。这个标记蛋白要求可与RNA结合，并可在细胞质和细胞核中穿梭，剪切过程中所涉及的 SR蛋白可能就起到了这个标记蛋白的作用。
由此，我们就可推测得到在酵母细胞和哺乳动物细胞中NMD机制的一个共同模型。在转录及随后发生的 讨衜RNA与蛋白结合而被包装成为 RNP，我们将之定义为核内RNP。这些RNP被从核中转运到细胞质中。转运过程中，蛋白质的表达机器就可与RNP相互作用，接着核糖体开始翻译 mRNA。在从核到质的转运过程中，RNP会有一个重新形成 ( remodeling ) 的过程，变为细胞质的RNP。用于翻译的核糖体是激活这一过程的一个组 分。核糖体从mRNA的5’端结合上去，并在上面移动，因而可以顺序替换下在核中结合于RNA上的蛋白，如Hrp1p，SR等。这些蛋白被从RNA上替换下来后可返回细胞核中。我们假设全长的多肽链的表达对于由核内RNP转变成细胞质RNP是重要的，而这种转变对于mRNA的翻译和稳定性是十分重要的。因此，当核糖体遇到使翻译提前终止的密码子时，RNP的重新形成不能进行完全，造成了异常的RNP结构，这种异常的结构就可被降解机器识别而迅速降解。
在这一过程中，Upf1p及监视复合物起到了重要的作用，它连接了从翻译终止到mRNA降解的两个过程。当核糖体在使翻译提前终止的终止密码子上暂停翻译时，这就传递了监视复合物的组装信号。Upf蛋白与eIF因子相互作用，加强了翻译的终止，同时，它与eIF的作用抑制了NMD所需的ATP酶和螺旋酶的活性，因而翻译终止不完成，NMD就不会启动。但一旦终止过程结束，由于Upf1p具有的螺旋酶活性，组装好的监视复合物就会沿着mRNA检测终止子的3’端。正常情况下，由于RNP上的结合蛋白已经被核糖体所替代，因而复合物不会碰到标记RNA异常的蛋白质，如果复合物接触到了与DSE结合的蛋白如Hrp1等，这个mRNA就会被认为是核内RNP 不完全转变成细胞质RNP的异常RNA。因此，转录产物的异常是靠监视复合物与一些标记蛋白的相互作用来完成的。当RNP结构被认定是异常后， mRNA就会被迅速脱帽并被降解。综上所述，提前终止的密码子和DSE在决定转录产物是否异常中依次发挥作用。翻译的终止导致了监视复合物的组装，然后监视复合物与DSE结合蛋白的接触辨别了mRNA的异常，并使之被迅速脱帽并降解。这就是NMD途径的一种设想模式。
除了这种DSE结合蛋白在不正常翻译终止后被监视复合物识别，引发mRNA衰变的模式外，也有人提出了其它的设想。Patricia Hilleren和 Roy Parker就提出，决定一个mRNA是否异常并成为mRNA监视的作用底物是由转录产物的3’末端的的mRNP区域（哺乳动物细胞中）或3’UTR结合蛋白（酵母细胞中）决定的。在哺乳动物细胞中，当3’末端形成及前体mRNA末端剪切时，就形成了3’末端的mRNP区，它或者酵母中的3’UTR结合蛋白标记了转录产物的3’末端。当翻译中的核糖体接触到末端的mRNP或标记蛋白时，这时发生的翻译终止被认为是正确的，mRNA也因而保持稳定而继续进行翻译。但如果翻译提前终止了，这时核糖体还没有接触到3’末端的mRNP结构或3’UTR结合蛋白，就意味着核糖体还没有到达mRNA 的3’端，这时的翻译终止就被认为是不正确的，mRNA也就会认为是异常的而遭到降解。
NMD的其它生物学意义及它与人类疾病的关系
NMD是细胞蛋白质生物合成中质量控制的重要一步。然而，在细胞中NMD失活后引起的后果并不是十分严重的，它并没有影响生物体生理活动的所有方面。在酿酒酵母中，UPF基因的缺失株除了在以乳糖和甘油为唯一碳源情况下，都可以近乎正常的生长。这显示出似乎UPF的缺失造成了线粒体功能的损伤。最近，UPF的缺失株又被发现NMD影响了端粒的长度，基因的沉默及着丝粒的组装等过程。另外，在线虫中还发现，NMD途径的损伤影响了性器官，并使生殖力减弱，这就证明了NMD途径在进化中具有的优势。
在酿酒酵母中，为了了解NMD的整体影响，有人利用基因芯片技术研究了UPF基因失活后的各mRNA水平的变化，结果发现UPF三个基因中任一个或三个的失活均会导致至少8%的mRNA的量发生变化。在变化的 mRNA中，90%的含量增加，10%的含量减少了。初步证实，大部分NMD敏感的mRNA并不是NMD直接作用的靶向，它们的含量变化并不是由于半衰期变化引起的。事实上，NMD的直接作用对象可能是编码一小部分转录因子的mRNA。由于编码转录因子的mRNA含量发生变化，因而这些转录因子的作用对象的转录就会受到影响。而且转录因子是activator还是 repressor，也会决定相应的mRNA含量是增加还是减少。由此我们可以看到，NMD在细胞中的作用是广泛而复杂的，它不仅可以避免产生具有潜在危害的蛋白质，还在一个广泛的层次上参与了蛋白质生物合成过程中除翻译水平之外的调控。
另外，在人体的遗传病与癌症的病原学中，NMD也起着十分重要的作用。89%的引起毛细血管扩张的共济失调的ATM基因突变及77%的与乳腺癌相关的BRCA1基因突变都会导致翻译提前终止，而这些突变均会引发 NMD。目前，在引发疾病基因突变中，很多都是导致链终止的突变，这些都与NMD有着密切的关系。由于突变，NMD途径降解了突变的mRNA，而细胞中同时也缺乏了正常功能的蛋白，因而常常会导致疾病。因此，如何对这些疾病进行基因治疗就需要我们对mRNA监视的机制进一步了解。真核细胞中NMD途径的研究已经告诉了我们一些有关基因表达中的错误如何被发现以及转录后水平如何调控基因表达的新的知识，那么在将来的研究中，如何利用已知的NMD的知识为疾病治疗方法提供思路就将是我们关注的重点。
参考文献
1. Michael R. Culbertson. RNA surveillance. Unforeseen consequence for gene expression, inherited genetic disorders and cancer. Trends Genet. 1999 Feb; 15(2): 74-80.
2. Kevin Czaplinski, Maria J. Ruiz-Echevarria, Carlos I. Gonzalez, Stuart W. Peltz. Should we kill the messenger? The role of the surveillance complex in translation termination and mRNA turnover. Bioassays.1999 Aug; 21(8): 685-696.
3. Patricia Hilleren, Roy Parker. mRNA surveillance in eukaryotes: Kinetic proofreading of proper translation termination as assessed by mRNP domain organization? RNA. 1999 Jun; 5(6): 711-719.
4. Matthias W. Hentze, Andreas E. Kulozik. A Perfect Message: RNA Surveillance and Nonsense-Mediated Decay. Cell. 1999 Feb5; 96(3): 307-310.
5. Hilleren P, Parker R. Mechanisms of mRNA surveillance in eukaryotes. Annu Rev Genet. 1999; 33:229-260.
