单克隆抗体在癌症治疗方面的应用

单克隆抗体在癌症治疗方面的应用
作者    张宇

    在过去的近20年里，作为一种具有治疗人类癌症潜在可能的手段，单克隆抗体(monoclonal antibodies，mAbs)受到了人们的广泛关注，应用单克隆抗体治疗癌症的研究也正在深入的进行当中。现在我们已经知道，癌症细胞受自分泌和旁分泌的生长因子的刺激而增殖。这些生长因子和它们的相关受体大部分都是与癌症相关的蛋白，它们在人的癌变中通常是过量表达的。因此，利用抗生长因子受体的抗体作为治疗手段来破坏受体功能的发挥，或用单抗作为受体靶向的携带药物的载体，都是癌症治疗中具有极大潜力的方法。目前，我们已经对一系列针对人生长因子受体的鼠源单克隆抗体进行了深入的研究。这些单抗主要针对的是这样一些生长因子的受体：表皮生长因子( epidermal growth factor, EGF)，HER－2(c-erb-2/neu)，转铁蛋白，胰岛素样生长因子(insulin－like growth factor)，白细胞介素1(淋巴细胞激活因子)，白细 胞介素2(T细胞生长因子)等。此外，一些研究的较为清楚的鼠的单抗已经被人源化，以用于临床研究。下面，我们就将以表皮生长因子受体和跟它同源性很强的受体HER－2为主，来关注一下有关抗生长因子受体的单克隆抗体在人类癌症治疗方面的进展。

单克隆抗体对表皮生长因子受体功能的破坏

    现在已经证明，抗体可以阻断受体的生物活性并明显改变细胞的生理功能。例如在患有自身免疫性疾病如重症肌无力的患者中，病人血清中存在的抗乙酰胆碱受体的抗体可以明显的阻断受体的功能，并直接扰乱神经信号从而扰乱了细胞正常的生理功能。这就为运用单克隆抗体阻断生长因子受体的功能，从而作为癌症治疗的手段提供了坚实的理论基础。通过几十年的研究，生长因子在人的癌症细胞增殖中的重要作用已经是被公认的了。在人的表皮原发性肿瘤中，表皮生长因子具有广泛的高表达，同时，在很多的人的肿瘤细胞中，都存在着潜在的表皮生长因子介导的转化生长因子TGF的自分泌激活途径，这些都促使人们研究利用抗体来阻断生长因子配体的结合的治疗途径。一些具有结合EGF受体并阻断配体的结合能力的鼠源的单抗就已经被发现可以阻止不同的人肿瘤细胞系的增殖，这个发现在培养细胞和异种移植模型中都得到了证实。

    目前，一些鼠源的抗EGF受体的单抗已经进入了临床一期和二期评估，这些单抗主要被用于表皮和中枢神经系统的恶性肿瘤的治疗。mAb225，经 111In标记后，被发现成功定位在原发性的肺癌中及转移的癌细胞中，而且可以阻断配体与受体的结合。这个研究已进入了临床一期治疗，在具有一定治疗效果的同时，血浆中的单抗在使受体饱和的水平下，三天之后仍没有产生明显的副作用。另一个具有相似特征的单抗mAb425，与125I结合后，被用于复发的恶性神经胶质瘤的治疗中。另外，mAb108(RG83852)在一期治疗中，表现出与EGF受体的高亲和力位点的结合，从晚期鳞状细胞瘤病人的肿瘤活组织检查标本中发现，它几乎可以饱和EGF受体。以上这些都是利用抗生长因子受体的抗体阻断受体和天然配体的结合而影响生长因子功能方面特性而进行的应用。

    在这些研究进展之外，我们同时也观察到，成胶质细胞瘤细胞经常表达的是突变的EGF受体，这就为研究提供了一条新的可能性，即开发针对突变后受体的具有抗肿瘤特异性的受体的单克隆抗体，这就提高了抗体定位的准确性，减少了抗体影响正常细胞上生长因子受体功能而产生的副作用。这方面的临床研究正在进行当中。

    除了直接影响受体和配体结合从而影响生长因子的功能之外，单克隆抗体同样可用来干扰细胞周期，这是在生长调节的信号传导途径方面单抗的应用。在转化生长因子TGF－α的自分泌途径中需要EGF受体发挥作用，因此，利用单抗和EGF受体的结合，也就相当于生长因子的缺失，就会导致细胞 周期在G1期的可逆转的停滞。另外，随细胞的不同，这种由于单抗造成的细胞周期的停滞在程度上也有不同。在肿瘤细胞系中，单抗造成的是不完全的G1期的停滞并带来增殖的减少，而在非恶性细胞系中，单抗几乎造成了G0期的完全停滞。那么，这种由于EGF受体阻断而造成的生长周期的紊乱是通过什么途径完成的呢？现在发现，这种紊乱至少是通过一条共同的途径，即抑制CDK（cyclin－dependent kinase）的活力来实现的。这种抑制还伴随着 一种CDK抑制剂p27kip1水平的增加，这种抑制剂可以和CDK－2结合。目前 还发现，由单抗造成的G1期的停滞一般很少引起细胞凋亡造成的细胞死亡，但在某些细胞系中却有例外，具有应用价值。这方面的机制和应用研究都还有待进一步的发展。

克服对鼠源抗体的免疫反应的策略

    但是，以上这些方面的研究在应用时都或多或少存在一个问题，那就是人对鼠源抗体存在着免疫反应。当病人注入鼠的抗体时，在2到4星期内就会产生针对外源单克隆抗体的免疫反应，如果病人继续被注入此种抗体，就会发生典型的变态反应，产生如发冷，寻麻疹，哮喘等症状，这种抗体也会很快从血液中清除。那么，如何避免这种免疫反应呢？目前有这样几种解决的途径。

    将鼠源抗体人源化无疑是一条最好的解决办法，也就是说研究人鼠的嵌合抗体。首先，我们找到在抗体的可变区中对于和抗原结合十分重要的氨基酸，这些氨基酸或氨基酸序列决定了抗体与抗原结合的互补性相关区域。当这些区域明确后，就可以把编码这些区域的相关的DNA序列通过基因工程手段转入人的免疫球蛋白编码DNA框架中，形成重组的免疫球蛋白DNA。重组后的DNA被放于一个细胞内系统，继而被转录，翻译，糖基化并被分泌到培养液的上清中。这时，纯化后我们得到的蛋白就是所需的人鼠嵌合抗体了。利用这种方法，我们将鼠的抗EGF受体的mAb225IgG1与人的同型的IgG1嵌合，形成了嵌合的mAb225(C225)，改造后的单抗完全保留了鼠源的mAb225与EGF竞争受体结合的活性，在一系列癌细胞的培养系和异种移植模型中，它都具有与鼠源单抗相似甚至有所增强的广泛的抗肿瘤活性。较改造前更具优势的是，嵌合的mAb225可以持续对病人给药达三个月之久而不会产生病人对抗体的免疫反应，目前，关于这个嵌合抗体的研究已进入了临床二期治疗。

    除此之外，阻断人体的免疫反应也是一条途径。Dhingra等人就找到了这样一种可以阻断人体对T细胞依赖型和T细胞非依赖型抗原的免疫反应的药物，这就是从芽孢杆菌中分离得到的脱氧精胍菌素。它可以抑制针对具有高免疫原性的蛋白如假单孢菌的外毒素的抗体的产生，甚至在临床前的移植研究中，脱氧精胍菌素还能抑制和逆转移植的排斥反应。在一个临床一期研究中，利用一个可识别腺癌和非小细胞肺癌的鼠源的单抗L6进行治疗，三分之二的病人在25天内都产生了人抗鼠的抗体(human antimouse antibody,HAMA)， 相反，在使用了脱氧精胍菌素的24个病人中，只有两个病人在82天中产生了HAMA，产生免疫反应的人数明显减少。

联合治疗途径

    在大部分情况下，用抗体阻断EGF受体与配体的结合只会导致抑制细胞的增殖的结果，而不会具有杀细胞的效应。因此，为了治愈癌症，将抗体与其它作用于细胞周期或导致细胞凋亡的物质联合起来进行治疗无疑是一条好的解决办法。这方面的尝试包括将抗生长因子受体的抗体与传统的化疗结合，将抗体与细胞因子结合，将抗体与在级联的促有丝分裂信号转导途径中的不同环节中起作用的新的抑制剂结合等联合治疗方法。这种联合治疗是有理论基础来支持的。最近的研究显示：化疗诱导的细胞毒性和细胞程序性死亡中涉及的存活因子被除去后导致的细胞死亡这两种不同的途径都显示出了相似的细胞毒途径，这种作用在两种方法联合使用中会被加强。这无疑显示联合治疗会具有较理想的效果。

    在对mAbs225和528的研究中发现，单抗与顺氯氨铂(一种抗癌药)或阿霉素的联合治疗都能有效消除人的异种移植的鳞状细胞瘤，而同种情况下，两种方法的单独治疗的效果都是不理想的。利用抗HER－2的单抗4D5与顺氯氨铂的共同治疗也得到了相似的结果。而在表达高水平的HER－2的培养细胞中，将化疗和酪氨酸激酶的抑制剂AG825共同使用，同样观察到了这种协同作用。由这些结果都可以看出，使用单克隆抗体作为治疗的手段是一条新的可行方法，但这并不意味着，其它一些传统的方法或治疗手段与之是互相排斥的，为了得到最好的治疗效果，不同方法的联合使用无疑是可行的。在临床上，联合使用人的4D5单抗和顺氯氨铂治疗晚期的乳腺癌的研究已进入了二期研究。治疗产生效果的比例为20%，这比单独使用顺氯氨铂的比例高很多。同时，利用人源化的单抗4D5与化疗共同治疗转移的乳腺癌的病人的研究也已进入了三期治疗。

    联合治疗的另一个方面是将抗体和干扰信号传导的多步过程从而抑制癌细胞的增殖的抑制剂联合起来使用。在这方面，近来的研究发现，处理培养细胞时，用蛋白激酶A或法尼基转移酶的专一性抑制剂共同处理后，抗EGF 受体的mAb的作用被加强了，其协同作用也是明显的。

一些新的抗体类型的应用

细胞内抗体

    除了直接作用于细胞表面的生长因子受体外，抗体还可以在靶细胞的细胞内表达来发挥功能。这种方法是由将包含了轻链和重链的可变区的单链的抗体片段(scFv)通过重组病毒等载体转入靶细胞内来实现的。当scFv在靶细胞中表达出有功能的产物后，在细胞内的特定区域内，它就可以和相应的目标分子结合，从而阻止这些分子通过内质网的运输和分泌，这样就可以使目标分子的功能失活。细胞内抗体可以被用于选择性的“敲除”特殊的与癌症相关的蛋白，从而产生了一条抗癌治疗的新方法。在对EGF受体和HER－2的单链抗体scFv的研究中发现，在细胞内内质网表达的抗HER－2的scFv抗体可以显著下调细胞表面的HER－2的水平。同时，这一现象还同时伴随着HER－2过量表达的细胞的增殖受抑制，细胞内存在的抗体甚至还可以通过诱发细胞凋亡而将相应的肿瘤细胞杀死。另外，抗HER－2的scFv还被发现可以逆转由HER－2导致的NIH3T3细胞的转化，即使转化的表型消失。从抗EGF的受体mAbR1中得到的细胞内表达的单链抗体片段的研究中，科学家们也得到了相似的结果，细胞内的抗体可以抑制表达EGF受体的NIH3T3细胞和一些癌细胞系的生长。这项技术无疑是极为吸引人的，但目前这方面的研究都还需要进一步的证实其体内水平的作用有效与否，以达到临床上的应用。

双功能抗体

    双功能单克隆抗体（bispecific monoclonal antibody，bsmAb)的开发同样 是人们关注的热点之一。从理论上讲，适当的抗体和肿瘤细胞的结合就会导致肿瘤细胞被免疫细胞识别而被吞噬，但尽管单克隆抗体可以结合肿瘤，在体内却缺乏证据显示这种依赖于抗体的细胞毒性。而双功能抗体则可以较好的解决这个问题。双功能抗体具有双重的特异性，它可以专一性的识别一个与癌症相关的抗原，同时，它的另一个特异性识别位点可以结合一个引发细胞毒性的分子，如白细胞表面受体，或化疗药物等，继而一些免疫效应细胞如T细胞，天然杀伤细胞或巨噬细胞等或化疗药物就可以通过抗体带到特定的靶细胞上而定向发挥功能。双功能抗体可以通过把两个独立的Fab’片段由化学交联而连接到一起而得到，具体的做法有两个途径。一个是将两个单克隆的杂交瘤细胞融合成一个杂合的杂交瘤，并通过筛选得到表达所需抗体的杂交瘤，而另一种方法是通过重组抗体技术得到重组后的双功能融合抗体分子。

    由于在很多人的肿瘤细胞上都有相对于正常细胞的过量表达的生长因子受体如EGF受体，HER－2等，因此，利用这些受体来开发可特异性的定位的双功能抗体并进行肿瘤治疗的研究也正在积极进展当中。如可特异性的识别 EGF受体并同时具有激活CD3功能或与阿霉素结合的双功能抗体，特异性的识别HER－2并可激活CD3、CD64(FcγRI)、CD32(FcγRII)、CD16(FcγRIII)等的双功能抗体等。这些研究的结果都很相似，双功能抗体可以明显加强T细胞、天然杀伤细胞、多形核白细胞的对肿瘤细胞的专一性的毒性作用。而现阶段进入了一期临床研究的双功能抗体有：由杂合的杂交瘤得到的2B1，它包括了识别HER－2的mAb 520C9和识别CD16的mAb 3G8，通过化学交联 Fab’片段得到的包括识别HER-2的mAb 520C9和识别CD64 的mAb H22的双 功能抗体等，而且在这些抗体的研究中都没有观察到不利的毒性作用。

    利用这样的思路，受体的天然配体也能用于相似的融合蛋白的组建和表达，利用天然配体代替抗体来达到相似的定位功能。H22－EGF就是将编码人的抗CD64的 mAb H22片段的基因和编码EGF的基因融合后表达的双特异 性的融合蛋白，它可抑制EGF受体过量表达的肿瘤细胞的生长并在CD64效应细胞存在下介导细胞的细胞毒性作用。 

抗生长因子受体抗体的融合蛋白

    将抗体的专一性结合能力和多功能的细胞因子的细胞毒性或毒素联合起来的方法除了双功能抗体外，用遗传工程的方法得到的抗体融合蛋白也是一个有效的途径。这种方法是将编码毒素或细胞因子的基因和编码单克隆抗体的基因融合起来，融合后的基因由细菌表达载体表达就可得到将单抗和细胞因子或毒素结合在一起的融合蛋白了。随着重组DNA技术的进展，这方面的 进展也较快，现在已经可以用单克隆抗体的一些单链片段作为识别区来掺入重组分子中了。很明显，这种新的融合蛋白较传统的将单抗和毒素用化学交联方法结合的产物有着很大的优越性。例如，由于抗体的单链融合蛋白比交联分子小的多，因此，在大的肿瘤中，它们就有更强的穿透力。而且，融合蛋白也更容易生产和纯化，在功能活性上也更稳定和一致。

    现在，对于过量表达EGF受体或HER－2的癌细胞，利用抗体－细胞因子或抗体－毒素的融合蛋白作为治疗手段的研究正在进行当中。这些研究包括包含抗EGF受体的单抗和白细胞介素2或淋巴毒素的融合蛋白，包含抗HER－2的单抗和B7－2（CD80）的融合蛋白。这些蛋白都被发现可以将有活性的分子定位于癌症发生位点，这种局部位点的活性分子的聚集足以激发相应的免疫反应从而导致肿瘤的减小。

    例如，重组的免疫毒素scFv(225)－ETA和scFv(FRP5)－ETA分别包含了一个单链的抗EGF受体(225)和HER－2(FRP5)的单抗，并且融合了从假单胞菌中得来的外毒素（ETA）。scFv(225)－ETA可以专一性的抑制高水平表达了EGF受体的培养或异种移植的癌细胞的生长，同时，scFv(FRP5)－ETA也表现出了抑制高水平表达HER－2的癌细胞的生长的活性。另外，由于有一些癌细胞会同时表达EGF受体和HER－2，而且这两个受体在细胞转化过程中会有协同作用，因此，我们可以寻求一些其它的途径来增强免疫毒素的作用。现在已经构建和表达了双价的scFv2(FRP5/225)－ETA和双价的scFv(FRP5)－TGF－α－ETA等，这些新的免疫毒素是在原来的一个单抗和一个外毒素的基础上，多融合了一个受体专一性的单抗识别区或者多融合了一个转化生长因子α。这样，由于这些新的免疫毒素有更强的定位作用或更强的毒性，因而对于癌细胞，特别是共表达两种受体的癌细胞的治疗效果比单价融合免疫毒素要 好很多。

    在成胶质细胞瘤及一些乳腺，卵巢，和肺的一些癌细胞系中发现的突变的EGF受体，EGFRvIII，相对于正常受体，它们的细胞外的区域有一些缺失。因此，根据这个特点，可以设计出包含针对EGFRvIII的专一性的scFv和假单胞菌的外毒素的重组免疫毒素，它对于表达EGFRvIII的鼠的成纤维细胞和转入了EGFRvIII的成胶质细胞瘤细胞都有专一性的毒性，但对于不表达这种突变受体的细胞却没有毒性。这无疑也是融合蛋白的重要应用领域之一。


    目前，已经有了充足的证据证明了抗生长因子受体的单克隆抗体对于人类癌症治疗的巨大应用价值。同时，在现在的研究中，这两个方面的研究是受到人们广泛关注的：即单克隆抗体引起的生长因子受体功能的紊乱和单克隆抗体介导的分子和治疗药剂的定位。这些方面的临床治疗研究也正在积极的进行当中。上面介绍的这些方法和应用正是这两个方面的具体应用，而在将来的研究中，还有这样几个方面是值得继续深入的：肿瘤细胞在缺失生长因子情况下发生的细胞周期的紊乱和细胞死亡的机制研究，单抗和其它治疗手段如化疗，信号转导的抑制剂等的联合治疗疗效的增强等。而在重组抗体分子方面，如何设计和生产新的更有效的基于抗体的多功能融合分子是我们所要解决的最关键的问题。

    在利用生长因子受体来进行癌症治疗的时候，我们还需要特别注意一个问题，那就是大部分的生长因子的受体不光在癌细胞上有高水平的表达，在 正常细胞上同样存在，并且还是重要的信号传导分子，发挥着重要的功能。因而在使用抗受体的单克隆抗体来进行抗癌的临床治疗时，必须仔细考虑它是否具有潜在的危害性。而利用癌细胞和正常细胞的特异性的生长因子受体的表达数量上的差异，而使细胞对单克隆抗体干扰受体功能的作用的应答产生程度上的极大差异这一特点无疑是一个很好的思路。



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