线粒体和神经衰退性疾病

线粒体和神经衰退性疾病
作者 徐金飞

摘要：
神经细胞死亡是人类神经衰退性疾病（Neurodegenerative Disease，ND）的一个中心特征，而细胞呼吸链的损伤被认为是引起神经衰退性死亡的一个重要原因。在正常细胞中，由于呼吸链中的质子和电子的转移而在线粒体膜两侧产生了电位，该电位促使了ATP的形成。一旦膜通透性受影响，能量代谢就要受到影响。线粒体膜上的渗透转运孔（Permeability Transition Pore，PTP）调节着线粒体基质和胞质中的离子和蛋白因子的转运。PTP的失控会导致膜电位的丧失从而阻碍了能量代谢，也会使得线粒体内的凋亡起始因子（Apoptosis Initiating Factors，AIFs）逸向细胞质中，从而引发凋亡。线粒体经NO和ONOO－处理后，其中的复合物I、II、III、IV的活力都会受到不同程度的抑制，PTP也会受到影响，这些结果都会直接或间接地导致细胞死亡。在神经细胞中，由于各种因素引起的细胞死亡会导致神经衰退性疾病，如：帕金森氏病（Parkinson’s Disease，PD）、艾尔滋曼病（Alzheimer’s Disease，AD）、亨庭顿病〔Huntington Disease，HD〕等。
关键词: 神经衰退性疾病（Neurodegenerative Disease）、凋亡起始因子（Apoptosis Initiating Factors）、渗透转运孔（PTP）、线粒体膜电位（DYm）

引言：
线粒体能量代谢的缺陷被认为是产生神经衰退性疾病的原因[1][2]，在动物实验中，由损害线粒体呼吸链的毒素而引起的病变的症状与某些人类神经衰退性疾病很相似。MTPT和3－硝基丙酸损害复合物 I 和 II，并使猴子产生出与PD和HD很相似的神经衰退性疾病症状[3]。有些试剂，比如辅酶Q10 和尼克酰胺，加快了呼吸链中的电子转运，减轻了在猴子中的由MTPT引起的类似于PD的症状[4]。复合物I的活性在患PD的病人死后的脑组织中下降了[5][6]，而复合物II、III、IV的活性在患AD的病人的脑组织中也下降了[7]。细胞色素氧化酶的活力的下降也是患AD的病人的线粒体复合物IV缺氧的一个体现[8][9]。有报道说在AD脑组织的外皮层中细胞色素氧化酶的亚基I和III的mRNA水平有下降[10]。复合物II和III活力在HD的尾状核中有下降也已被发现[11]。在患PD病人的血小板和白细胞中人们发现了复合物I的缺失[12]。AD病人血小板中的细胞色素氧化酶活力有下降也已有报道[13]。其它的研究显示了在PD的成纤维细胞中复合物I的活力也有所下降[14]。以胞质杂种作为原料来研究的结果表明，在PD的血小板中复合物I的活力下降，而且，在AD的血小板中细胞色素氧化酶的缺失能够被传递到受体细胞的下代[15][16]，这显示了在PD和AD中复合物活力的降低是由线粒体基因组的内源性影响引起的。
据推测线粒体呼吸链的缺陷可能会通过减少ATP或者增加ROS（Reactive Oxygen Spieces）的产物而引起神经衰退性疾病[2][16][17]。在AD脑组织中线粒体的膜流动性降低[18]和在PD脑中脂过氧化后蛋白加合物的增加[19]，被认为是ROS调节的膜过氧化的结果。根据这个观点，在神经中的细胞死亡可能是直接由线粒体产生的ROS引起的。另外,NO以及其氧化物(如, ONOO－)对线粒体呼吸链中的四个复合物的活力有很大的影响,从而影响到凋亡。最近的研究支持另外一种方式，即线粒体功能障碍可能会引起神经细胞死亡这被称为凋亡。
现在我们相信线粒体在引起某些凋亡的起始的过程中发挥了关键性的作用。一开始，凋亡被认为和线粒体因子没关系[20][21]。线粒体在凋亡起始时的重要性的阐明是由于发现了线粒体中的一些因子能诱导染色质浓缩和细胞核裂解，而这些细胞凋亡的典型特征是在非洲爪蟾抽提物的无细胞体系中研究得到的[22]。当前的试验论据显示了细胞凋亡时包括了一系列事件的发生，如：线粒体膜电位（DYm〕的降低，线粒体渗透转运孔（PTP〕的开放以及被称为凋亡起始因子(AIFs)的线粒体小蛋白进入细胞质。这些观点为解释在神经衰退性疾病中线粒体呼吸链功能障碍的现象，提供了多种新的途径，而且还为神经衰退性疾病的治疗提供了新的治疗方案。

线粒体膜电位和凋亡
在理解线粒体和凋亡起始的关系时研究线粒体膜电位显得很重要。在线粒体内膜两侧的电化学质子梯度正常情况下为DYm=－150mv质子浓度在线粒体膜的不同部位有差异。DYm取决于线粒体复合物I、III、IV在用NADH、泛醌和细胞色素氧化酶 C 将质子通过内膜泵出线粒体基质的能力。复合物II将能量从FADH2转至泛醌但不泵出质子。向外泵出质子产生了一个电子梯度，这在生物化学中可用DPH体现，而在电学上用跨线粒体内膜的电压表示，这种电压被称为线粒体膜电位（DYm）[23]。DYm和DPH对质子的电驱动力（dp）都有贡献（dp＝DYm－60DPH），这儿DPH＝mPH－cPH(mPH代表线粒体PH，cPH代表胞质PH)。dp在复合物V中促使ADP向ATP转变。因为DYm对dp的贡献最大，因此在绝大多数情况下，DYm被假定为与ATP/ADP转化率有线性关系，这就为线粒体提供了一个估算ATP/ADP转化率的标准。
通过使用整细胞电势荧光染色法,我们可以看到在很多的血细胞、肝细胞和免疫细胞中，DYm在凋亡过程中很早就降低了，比核DNA裂解和染色质浓缩还要早[24]。最近，利用激光聚集图象在NGF分化的PC12活细胞中直接获得了DYm的测量方法，并显示了DYm的降低，如不是最早发生的话，也应是最早发生的事件之一[25]。DYm的降低比核DNA裂解和胞质浓缩要早3－6个小时。DYm的下降和线粒体内Ca2+浓度增加有关而并不是由胞质内ROS水平的增加引起的，因为ROS水平的升高只发生在DYm的降低稳定以后。DYm的降低和与其同时发生的线粒体内Ca2+浓度的增加诱导了PTP的开放[26]。相应地，在凋亡早期发生的变化也有利于PTP的开放。

渗透转运孔（PTP）与细胞凋亡
DYm的下降和线粒体内Ca2+浓度的升高[26]引起了横跨内膜和外膜的PTP的开放。有关PTP的纯化和体外重组的详细资料最近已有出版[27][28]，但是PTP的精细结构还不明确[29]。腺苷酸转位因子(AdNT)是PTP的一个关键组分，但是到底是这一个因子组成了孔，还是它紧密连接了成孔蛋白而形成了孔还不清楚。PTP还包含了一个电压门阴离子通道和一个边缘苯丙二嗪受体，这些组分紧密结合了己糖激酶、肌酸激酶和BCL－2以及其它因子，例如：甘油激酶、磷脂过氧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、3－b羟甾类脱氢酶异构酶和心磷脂合成酶。
PTP在DYm降低而Ca2+浓度上升时开放[30]。在线粒体内Ca2+浓度显著上升增加了氧化基团数目，或使呼吸链中单独起作用或共同起作用的部分失效。这些都能诱导DYm的下降[31]。PTP的开放去除了横跨线粒体膜的质子梯度，也进一步降低了DYm[32]。从理论上来说，PTP的开放本身诱导了凋亡，但是这些凋亡的起始更象是降低了引发凋亡的条件[30][32]。PTP的完全开放使线粒体基质和胞质中小于1500Da[33]的溶质或蛋白能自由交换，这能引起线粒体外膜的破裂，并释放出热不稳定的凋亡起始因子（AIFs）(例如CytC)[34-37]。在膜内的AIFs（例如CtyC〕不从PTP转运[38]，它们能从线粒体膜的裂逢中释放出来。谷胱甘肽集中在线粒体基质中，谷胱甘肽被认为是能通过PTP的最大分子[39]。
一些因子影响着PTP的开关状态。那些有利于孔关闭的因子是反凋亡的，而那些有利于孔开放的因子促进了凋亡。环孢素A与PTP结合，并在一个邻近的位置维持它的开关状态。环孢素A还通过结合亲环蛋白而促使孔关闭。这些亲环蛋白通过结合AdNT并在Ca2＋存在时引起PTP开放[30][32]。有些因子（如：在线粒体基质中的谷胱甘肽、ADP的水平、ROS水平〕调节了电压门，它们对诱导PTP开放是必须的，但它们本身并不能足以开放PTP[40]。反凋亡蛋白BCL－2以和环孢素A相似的方式维持了PTP关闭。最近发现PBR和BCL－2的表达水平和淋巴样细胞相关，而且BCL－2与PBR与其共免疫沉淀[41]。这些发现显示了BCL－2可能可以和线粒体PTP的PBR组分结合。通过实验还发现BCL－2定位在线粒体膜外层[42-45]或接近线粒体PBR的地方[41]。被截了接头的BCL－2不能泊在线粒体膜上，而保存在胞质中。它们比定位在线粒体膜上的BCL－2阻抑凋亡的效果要差[46]。Richter首先提出BCL－2通过维持膜电位而阻止凋亡[31]。Zamzami和他的同事们随后为这个观点提供了更有说服力的证据，并显示了BCL－2维持PTP的关闭[47]和通过阻止引起凋亡起始的热不稳定因子的逸出，而阻止了凋亡起始。很多其它的研究也显示了BCL－2能阻止DYm的下降和白细胞介素转化酶样起始因子（ICE－like AIFs〕的释放[34][36][37]。BCL－XL同样地调节着DYM[48]。PTP的开放是在许多凋亡形式中的关键步骤，并被认为是在凋亡过程中不可逆转的步骤[47]。

凋亡起始因子〔AIFs〕
研究发现线粒体匀浆对无细胞系统中凋亡时细胞核的变化过程是必须的，这说明线粒体因子在凋亡起始时起着重要作用[22]。几种促使凋亡的线粒体AIFs已经被发现。全细胞色素C是核编码的14KDa蛋白，正常情况下定位在线粒体内膜空间，和dATP结合，能在一些无细胞系统中促使核DNA发生凋亡变化[50]。另外在一些凋亡的途径中，在凋亡早期就能在胞质中发现细胞色素C[51]。注射CytC进入细胞也引起了凋亡[52]。CtyC从线粒体释放后，激活了一个Capase3的酶原，导致了一个内切酶的活化[51][53][54]。另一方面，反凋亡试剂BCL－2可以阻止CytC从线粒体释放[51]。
在高或中等水平的DYm存在时,CytC定位在它在线粒体内的本来的位置上。在低水平的DYm存在时，线粒体内的CytC水平大大地降低了，而相邻胞质中的CytC水平相应地上升。重要的是，我们发现在一个细胞的所有线粒体中，相对少量的线粒体的DYm下降，能引起胞质内可观察的CytC免疫密度的上升。别的研究没有发现在线粒体内DYm的下降先于胞质CytC的上升[55]。检查所有的线粒体DYm的变化时发现有些线粒体与胞质中的CytC水平上升有关。
另一个已经被确认的线粒体AIFs是白细胞介素转化酶样（ICE）蛋白酶。它能被N－苄氧基羰基－Val－Ala－Asp氟甲基，协同抑制（这是一个对ICE家族专一的抑制剂）[37]。BCL－2已经被证明能阻止这个AIFs的释放可能是通过维持PTP的关闭[37]。几个定位在细胞质中的小蛋白的细胞内转位，已经被认为和凋亡有联系。Hunot et al 发现培养的多巴氨神经元被肿瘤坏死因子a（TNF璦）刺激后，诱导了NFk－B的核转位，这和诱导凋亡相联系[56]。有个情况还不清楚，那就是，是否NFk－B的核转位促使了细胞死亡或者保护细胞，使之免于死亡。3－磷酸甘油醛脱氢酶( GAPDH)是一个在糖代谢中起调节作用并与mRNA翻译有关的一个酶[57][58]。GAPDH通常以四聚体形式存在于胞质中并和RNA的富含AU序列区结合。在某些凋亡模型中，GAPDH在核内聚集和转录事件相关的凋亡有关。最初的数据显示NAD或ROS能替代GAPDH在胞质RNA上的连接点并使它在核内聚集。 

氧化程度和线粒体凋亡
和ATP产量下降有关的线粒体功能障碍和来源于线粒体的ROS的增长有关[59][60]。氧化基团的增加，尤其是线粒体内Ca2＋浓度的增加能通过开放PTP[40][62]，引起线粒体内膜蛋白硫醇基的交联[61]，而诱导凋亡。BCL－2是抗氧化剂[46]，而且可能通过这种机制提供抗凋亡的效果。由PC12细胞进入凋亡而引起的BCL－2含量的降低，和细胞质中氧化基团含量的增加有关[63]。相反，由于BCL－2过量表达而引起的减少凋亡的可能性，与ROS水平和膜脂过氧化水平都有关系[46]。同样的结果可用自由基清除剂处理而得到。自由基清除剂〔如SOD－1和谷胱甘肽〕，已经被证实能阻止PTP开放时氧化基团的直接作用[40][62]。这样，正如在PD和AD中观察到的，线粒体呼吸链活力缺失[5][7][64]可能是通过氧化基团的增加，以及通过DYm的下降，使质子泵能力下降，并开放PTP而导致凋亡。

线粒体和神经衰退性疾病中的凋亡
一开始线粒体没有被认为与凋亡的起始有关。产生这个观点的主要原因是因为发现，缺乏线粒体DNA〔mtDNA）的成纤维细胞（r0细胞〕会因为经过星形孢菌素的处理或营养缺乏而引起凋亡，而且这种凋亡模式能被过量表达的BCL－2抑制[20]。虽然在r0细胞中缺乏mtDNA，而包含了线粒体ATP产生所必须的蛋白的合成酶，但是它不含引起DYm的下降或使DYm下降后引起凋亡的因子。r0细胞利用产生于糖酵解的ATP来维持DYm，而DYm会因为TNFa或环己酰亚胺引起的凋亡而下降[35][65[66]。实际上降低DYm或高浓度的Ca2+能引起可溶的线粒体因子的释放。苍术苷的处理已经被确认为能引起无细胞体系中的凋亡[66]。这样mtDNA的缺失就不会影响线粒体维持DYm的能力，也不会和因为DYm下降并释放线粒体AIFs而引起凋亡有关。 
我们相信凋亡是在ND中细胞死亡的一个重要方式，而且早期的DYm的下降是一些凋亡方式开始的中心标志之一，并且导致PTP的开放和线粒体AIFs的释放。这说明能降低DYm或使PTP开放的试剂促进凋亡，而那些促使它关闭的试剂是抗凋亡的。这个理论解释了，凋亡为什么会被一些试剂(如：BCL－2,环孢菌素A和钌红 )抑制。BCL－2和环孢菌素A维持了PTP的关闭[22]，而钌红阻止了Ca2＋进入线粒体[67][68]。而且这个假说对ROS和线粒体复合物I的毒素（如MPP＋）以及胞质中Ca2+浓度的增加[70]怎样促进凋亡发展[69]，和SOD－1和谷胱甘肽阻止凋亡发生的可能性机制，作出了解释。最近这个理论能解释，为什么DYm在细胞翻译前后的降低与一些细胞现象联系在一起（如：细胞骨架解聚、细胞膜起泡、和染色质浓缩以及DNA链断裂）。
目前，还没有直接的证据说明DYm下降会导致人类神经衰退性疾病。在辅助研究中我们引进了激光聚焦显微技术并运用了电势计来测量在PD病人的皮成纤维细胞的DYm。图像分析表明PD病人的成纤维细胞的DYm有很大的降低。DYm降低可能使细胞更容易打开PTP开始进入凋亡。在PD、AD和HD中发现的线粒体复合物活力的下降，可能会使神经细胞由于质子泵的失效和相应的DYm的下降而易于凋亡。

一氧化氮和硝基（NO/ONOO－）对线粒体呼吸链的影响
现在已经有直接或间接的证据表明，在人类的神经衰退性疾病(如：PD、AD、MS)中线粒体受到了损伤。而且相对独立的各个实验验证了NO/ONOO－引起了线粒体呼吸链的损伤。在正常情况下，中枢神经系统中存在的NO有重要的生理作用[71][73]。而且NO被认为在痛觉感受和学习发生的生理过程中发挥了重要作用[72]。一氧化氮由一氧化氮合成酶在细胞O2存在的条件下合成。体外实验发现，所有的中枢神经细胞都有合成NO的能力。NO是一个自由基，它很容易和细胞内组分（如：超氧根离子）反应[74]，因此在很多生物系统中，它的半衰期很短。NO和O2－反应后生成了对细胞有毒性的ONOO－[75]。因为这个反应很容易发生，所以NO能和超氧化物歧化酶竞争O2－，而产生的ONOO－造成了细胞损伤。
离体心脏细胞线粒体经NO处理后会在细胞色素氧化酶水平上抑制呼吸链[76][77]。NO对线粒体复合物IV有可逆性抑制。ONOO－对复合物IV有不可逆性抑制。复合物IV的活性与线粒体内膜上的心磷脂浓度有关[78]，而ONOO－可能会通过对脂类的过氧化作用[79]而使得心磷脂丧失功能从而使复合物IV失效。而且似乎当ONOO－的清除基存在时，复合物IV就受到了保护。当离体的脑细胞线粒体经外源的ONOO－处理后，线粒体复合物II和III的活力会不可逆性地丢失[80]。而且当神经细胞经ONOO－处理后24小时再分析，发现呼吸链的复合物II、III的活力显著下降[80]。因此复合物II、III可能对ONOO－很敏感。在离体脑细胞中的线粒体复合物I似乎对ONOO－有抗性[80]，然而实验发现复合物I对ONOO－敏感性依赖于线粒体发育时的ONOO－的浓度和底物的存在情况[81]。另外ONOO－还会引起PTP的开放，可能的机制为：〔1〕，ONOO－诱导了线粒体内膜蛋白硫醇基的交联导致蛋白聚集和孔的形成；〔2〕，ONOO－诱导了脂的过氧化，这是通透性转移的潜在诱导因素；〔3〕，ONOO－诱导了线粒体呼吸链发生功能障碍。有报道说，肾脏细胞线粒体呼吸链被抑制会引起PTP的开放[82]。


总结与展望:
我们现在认为,在细胞凋亡过程中发生的一系列变化都与线粒体有关。总体来说在线粒体中发生的与凋亡有关的事件包括：（1）DYm的下降和细胞内Ca2＋浓度的上升相偶联。（2）PTP开放。（3）线粒体中可诱导凋亡的小蛋白因子逸入胞质。如果，DYm的降低确实是ND中线粒体发生变化的重要特征，那么，有关复合物I的功能障碍和成纤维细胞中的凋亡机制的研究会有助于阐明ND的病理机制。另外，对于特定器官的DYm的测量可作为早期ND诊断的指标。对于ND病人的特定器官中诱导凋亡的因子的研究，可以帮助人们找到引起疾病的因子和机制。我们可以推测，如果我们能找到阻止细胞凋亡的方法，那么我们就有可能有办法阻止ND的发生。 




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