细胞内环境的氧还调节和氧还因子-1(Ref-1)的研究进展（一）

细胞内环境的氧还调节和氧还因子-1(Ref-1)的研究进展

博士生: 严明达
导 师: 郑仲承 研究员

中 国 科 学 院
上海生命科学研究院
生物化学和细胞生物学研究所

摘 要

    正常的细胞生理代谢不可避免地产生活性氧分子（ROS及RNS）。一方面，细胞通过各种酶系和生物抗氧化剂清除胞内过多的活性氧，以避免细胞氧化损伤；而另一方面，活性氧分子又是细胞信号转导系统的组成部分，许多信号传递分子的功能可因其氧还状态的改变而受调控。在信号转导途径的上游部分，活性氧往往会通过抑制蛋白磷酸酶、激活蛋白激酶等方式起到增强信号的作用。胞内活性氧甚至有可能因响应胞外刺激而上调，进一步增强信号的传递，从而使活性氧行使第二信使的功能。而在信号转导的下游，活性氧所造成的氧化环境可以干扰氧还敏感转录因子中关键Cys残基的氧还态，抑制其DNA结合能力及其后的转录激活能力。信号通路上下游对活性氧的不同效应构成了细胞信号转导的双重氧还调节形式。因此，维持转录因子还原态的细胞氧还调节因子，如氧还因子-1(Ref-1)蛋白，就显得极为重要。由318个氨基酸残基组成的Ref-1是一个多功能蛋白，为胚胎正常发育所必须。它对转录因子的氧还激活功能由其独特的N端区域提供，而进化保守的C端区域赋予Ref-1无嘌呤/嘧啶核酸内切酶的活性，成为DNA碱基切除修复途径中的重要一员。越来越多的事实表明Ref-1基因在转录水平上受到各种胞外刺激，包括氧化刺激、激素、细胞因子的调控。另外Ref-1蛋白还能作为转录负调因子，对自身基因的表达形成负反馈调控。翻译后调控有CK II激酶导致的磷酸化修饰，以及与其他氧还因子如Trx相互作用导致的氧还修饰。它的组织分布呈现复杂的不均一性。胞内定位也并非总在核内，在一些氧化及激素刺激下还会发生从胞浆到核内的转位行为。Ref-1基因的表达往往与凋亡负相关，但又有可能通过激活p53而促进凋亡。Ref-1的不正常功能还与肿瘤发生、神经退行性疾病及老年化等密切相关。



    关键词: 活性氧，生物抗氧，胞内氧还环境，细胞氧还调节，氧还因子-1(Ref-1)，
转录因子DNA结合活性，转录因子转录活性

第1部分 细胞内环境的氧还调节

1.1 简介
    动物依赖绿色植物释放的氧气而生存。几乎所有需氧的化学反应过程均会产生化学反应性很强的活性氧分子（ROS），细胞中的生化反应也不例外。正常代谢所产生的超氧阴离子（O2˙－）、过氧化氢(H2O2)及羟基自由基(OH˙)等均属于活性氧的种类范畴。另外，细胞中还产生含有氮的活性氧，如一氧化氮(NO)和过氧亚硝酸根（ONOO˙－），通常又可称为活性氮分子（RNS）。

    活性氧的高度化学反应性势必会损伤细胞。遭受ROS损伤的蛋白质会聚集或断裂，虽然其中一部分可被蛋白酶或蛋白酶体所降解，但仍会有部分受损蛋白积累下来（如脂褐质就是一种过氧化脂蛋白的聚集物），影响细胞正常的生理功能。被ROS损伤的DNA更会造成复制中断、基因突变、遗传不稳定等一系列严重后果。人类疾病如关节炎、动脉粥样硬化、早老性痴呆、帕金森氏病，以及癌症、糖尿病、溃疡性结肠炎、局限性回肠炎、酒精损伤等，均与活性氧的氧化刺激密切相关。所以生物，尤其是动物，就自然有一整套的抗氧化机制来保护自己，减轻活性氧对细胞的损伤。

    但同时，活性氧又是生物正常生理活动所必须的介质。从其物理性质上看，ROS、RNS均是简单的小分子、小分子自由基或气体分子，可以自由通透质膜、穿越胞外空间，进入邻近细胞，在细胞间传递。如NO作为松弛素，能以“旁分泌”的方式自由地从血管内皮扩散进入血管平滑肌；作为神经递质，又可以通过神经突触传递于神经元之间(Lancaster, 1994)。近年来日趋深入的研究表明，活性氧在细胞信号传导过程中起着十分重要的调控作用。通过氧还修饰作用，活性氧可以改变信号分子的活性及功能，进而调节细胞的生长、分化、及凋亡等生理过程。

    本部分将着重介绍细胞内活性氧的产生与清除、细胞信号通路中各组分的氧还调节，并引出细胞信号转导的双重氧还调节概念。

1.2 细胞活性氧的来源及清除 （参见图1-1）

1.2.1胞内外来源 
    生物体内的ROS、RNS可源自胞外及胞内。来自胞外的化学因素（主要是各种环境污染物，如苯醌的氧还衍生物、NO₂、臭氧等）、物理因素（主要为UV及γ射线）和生物因素（如作用于细胞的各种因子等）都可以诱导细胞内产生ROS和RNS。

    细胞内部正常的生理代谢则是活性氧分子的胞内来源。

    细胞能量代谢主要依赖于线粒体的电子传递链产生ATP。在电子传递过程中，O2接受电子和质子而还原成水：O₂ + 4e^- +4H⁺ → 2H₂O。尽管绝大多数电子传递是十分有效的，但仍然会有少量的（约2％）单电子泄漏出电子传递链，部分地还原O₂，从而产生O₂˙^-（Boveris et al., 1973）。这一过程主要由在复合物III附近的辅酶Q介导。此外还有相当部分的H2O2在复合物I中以不依赖泛醌的方式生成。

    电子传递也发生于内质网中，其主要成员之一NADPH细胞色素P₄₅₀还原酶上泄漏的电子也可生成O₂˙^-(Cross et al., 1991)。类似的情况还发生于淋巴效应细胞质膜上的NADPH氧化酶。该酶将NADPH作为电子供体，将分子氧转化为过氧阴离子：NADPH + 2O₂ → NADP⁺ + H⁺ + 2 O₂˙^-；过氧阴离子在过氧化物歧化酶（SOD）作用下进而生成过氧化氢：2 O₂˙^-+ 2H⁺ → H₂O₂ + O₂。

    H₂O₂和O₂˙^-还只是中度活跃的ROS，但一旦转化成羟基自由基（OH.），则具有非常强的反应活性。这种转化除了自发的外，主要是在有Fe或Cu存在的条件下，通过Fenton或Haber-Weiss反应快速催化生成。

    NO由一氧化氮合酶（NOS）合成(Nathan et al., 1994)。精氨酸经NOS催化，其胍基被氧化生成NO和瓜氨酸。NOS共发现有三种同工酶，其中两种为组成型表达：血管内皮中的eNOS和神经元中的nNOS。它们均为钙/钙调蛋白依赖，合成的NO分别作为松弛素和神经递质。第三种同工酶称为iNOS，i意为可诱导的或免疫的，主要分布于淋巴细胞中的效应细胞如中性粒细胞、巨噬细胞、单核细胞中，在介导炎症和宿主抵制反应中起重要的病理角色。iNOS比eNOS和nNOS有更多的NO输出，与NO的病理作用相关，对入侵机体的不同源细胞如肿瘤细胞、细菌、病毒，以及某些正常的机体细胞如神经元细胞、少突神经胶质细胞等产生抑制乃至毒杀效应(Merrill et al., 1993; Mitrovic et al, 1994; Nathan, 1992)。

    NO与O₂˙^-快速反应生成过氧亚硝酸根：O₂˙^-＋˙NO → ONOO^-

    虽然NO可直接作用于胞内关键组分如铁硫簇从而导致其失活(Murphy, 1999)，但在反应活力上不及氧活跃，故往往通过其氧化物如上述的过氧亚硝酸盐/酯，修饰于蛋白质上产生细胞效应。

    除了上述的电子传递链酶系和一氧化氮合酶，次黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶、脂氧合酶、环氧合酶等也是内源性活性氧的来源。如有前列腺素合成酶H（同时具有环氧合酶、过氧化氢酶活性）和脂氧合酶参与的花生四烯酸代谢，在淋巴细胞活化时由于磷脂酶A2的激活而增强，会产生大量的活性氧(Kukreja et al., 1986)。此外，胞外来源的醌可以被NADPH-细胞色素P-450还原酶、NADH-细胞色素b5还原酶、线粒体NADH脱氢酶等催化发生单电子还原，产生半醌；半醌进而自发与氧反应产生氧自由基：半醌基＋O₂→醌＋O₂˙^-＋H⁺。

1.2.2 分子氧及活性氧的酶去除
    生化抗氧的第一道防线，是通过酶促反应直接去除多余的分子氧。这就是承担着胞内大部分分子氧去除功能的细胞色素C氧化酶，它能通过四价还原反应直接还原O₂分子，而不释放任何活性中间物。

    但如前所述，活性氧是细胞正常生理代谢的必然产物，它们的去除依靠以下诸多酶系：
超氧化物歧化酶SOD（EC1.15.1.1），催化O₂˙^-歧化为O2和水：2 O₂˙^-+ 2H⁺ → H₂O₂ + O₂。此酶是已知酶中速率最快的酶之一，Vmax=~2×109/M.s。真核细胞中主要有位于胞浆、核、溶酶体中的CuZnSOD(2mer)；位于线粒体中的MnSOD(4mer)；以及位于胞外的糖基化的CuZnSOD(EC-SOD, 4mer)。SOD的抗氧化功能自70年代末就有很多的实验证明。

    过氧化氢酶CAT（EC1.11.1.6），催化2H₂O₂→H₂O＋O₂。CAT是人们最早发现的酶之一，广泛存在于原核和真核生物中，有着古老的起源。由四个相同的亚基组成，约240kDa。通常位于过氧化物酶体中，也在线粒体、胞浆中出现。正常情况下在胞外体液中无CAT，但当HIV感染时会出现在人血清中。

    H₂O₂除了被CAT分解外，还可以被过氧化物酶（POX）分解：SH₂+ H₂O₂→S+2H₂O （SH₂代表还原性底物），当然POX顾名思义还可分解有机过氧化氢物（ROOH/LOOH）。根据对还原性底物的选择不同，POX分为非特异性过氧化物酶、细胞色素c过氧化物酶、NADH过氧化物酶、抗坏血酸盐过氧化物酶、谷胱甘肽过氧化物酶（GPOX）等。其中GPOX催化ROOH +2GSH→ GSSG＋ROH＋H₂O，是一种极少见的硒依赖酶。Keshan病是由于硒缺陷造成的退行性心脏病，就与GPOX活力低下相关。经典的GPOX(EC1.11.1.9，4mer)存在于胞浆中，也发现有胞外血浆中（PL-GPOX，糖基化蛋白，并无正常的GPOX功能）。在以过氧化脂肪酸为底物催化时，经典GPOX只能催化游离的过氧化脂肪酸，所以需要磷脂酶A₂先将过氧化脂肪酸从质膜上切下来。但另有一种可以直接作用于膜上的过氧化脂肪酸的磷脂单体GPOX（PH-GPOX），它需要更高的硒来维持活性。

    谷胱甘肽转移酶GST（EC2.5.1.18）是一个多功能的酶家族，参与对异源物质、过氧化物等的结合、解毒。GSTpx是指其过氧化物酶活性，催化2GSH＋ROOH→GSSG＋ROH＋H₂O。GST从细菌到脊椎动物普遍存在，真核细胞中分布于胞浆及线粒体中。结构功能的研究将GST家族分为α、μ、π、θ四个亚族。

    其他如酪氨酸酶（EC1.14.18.1，一种含铜的酶，参与黑色素的生物合成），可以将L-酪氨酸氧化为L-多巴，进而快速氧化为多巴醌。人酪氨酸酶喜好O₂˙^-作为底物，形成了捕获自由基的“陷阱”，可以在人皮肤中减少由于UV照射产生的O₂˙^-对黑色素细胞的伤害。还有DT-黄递素（又名心肌黄素、醌还原酶、硫辛酰胺脱氢酶），可以NAD（P）H为电子供体，催化二电子还原，直接将醌还原为氢醌，从而减少了上文提到的经单电子还原产生半醌，进而产生O₂˙^-。
各类活性氧清除酶是互相协调、互为补充的。如在豚鼠的肝、肾的胞浆中检测不到GPOX ，但大量存在CAT来清除H₂O₂，同时由GSTpx分解LOOH，就足以弥补GPOX的缺陷；相反，大鼠肝中有很高的GPOX，而没有CAT。

1.2.3 生物抗氧化剂
    逃脱活性氧清除酶的ROS还会被一系列的生物抗氧化剂所捕获。这些物质以“牺牲自己，顾全大局”的“气概”，及时阻断自由基的链式反应，防止了其他生物大分子的氧化。它们中脂溶性的有类胡萝卜素家族和维生素E类，水溶性的有抗坏血酸（维生素C）、谷胱甘肽、和蛋白类的硫氧还蛋白、各类金属结合蛋白等。

    类胡萝卜素家族已发现有600多种，其高度共轭双键系统能非常有效地清除O₂˙^-，从而阻断脂类过氧化的链式反应。在正常生理条件的较低氧分压下，β-胡萝卜素是最有效的（13—30×10⁹M/sec），可防止低密度脂蛋白的氧化，在防止或减缓动脉粥样硬化中起关键作用。类胡萝卜素广泛存在于各组织中，其中肝、肾上腺、肾、卵巢、脂肪等组织中主要为β-胡萝卜素，而睾丸中主要是番茄红素，视网膜斑区域含羟化胡萝卜素、黄体素和玉米黄质，却无β-胡萝卜素。这些组织分布的不同提示着类胡萝卜素种类作用的专一性(Sies et al., 1992)。

    维生素E包括生育酚和生育三烯酚，是保护细胞膜免受自由基损伤的主要抗氧化剂。生育酚可被自由基氧化成生育酚自由基，再到生育酚醌。此外，生育酚也是人低密度脂蛋白中的主要抗氧化剂。

    抗坏血酸是血浆中最有效的水溶性抗氧化剂（大概也正是其名称的由来原因），直接淬灭自由基，并间接影响其他抗氧化系统。抗坏血酸盐/抗坏血酸具有很低的氧化还原电位（0.282mV），所以几乎可以还原生物体内所有的自由基。抗坏血酸的氧化可以是单电子传递，生成抗坏血酸自由基；也可以是双电子传递，生成脱氢抗坏血酸（DHA）。抗坏血酸自由基和DHA不稳定，可自发地降解为无生物活性物质如二酮古洛糖酸。

    肽/蛋白类抗氧化剂主要有谷胱甘肽（GSH）和硫氧还蛋白（Trx）。GSH由γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶、GSH合成酶连续催化合成，胞内浓度约0.5-10mM。如前所述，GSH是诸多活性氧清除酶的还原性底物，反应后生成氧化态谷胱甘肽（GSSG）。胞内GSH、GSSG比例约为300:1。Trx是12kDa的小蛋白，其保守序列（Trp-Cys-Gly-Pro-Cys-Lys）中有两个半胱氨酸残基，可作为氢供体还原其他蛋白中的二硫键，调节靶蛋白巯基的状态。Trx与氧还蛋白-1(Ref-1)的协同作用将在第二部分中叙述。

    另一类蛋白类抗氧化剂是金属结合蛋白。如转铁蛋白能高效结合铁离子，从而阻断铁催化的自由基生成；白蛋白可以高效结合铜，阻断铜催化的自由基生成；血浆铜蓝蛋白（CP EC1.16.3.1）具有除了结合铜，参与铜离子的转运外，还具有亚铁/铜氧化酶活性，可以催化两价铁到三价铁、一价铜到两价铜的反应，而不会有ROS的产生：CP-[Cu(II)]4+4Fe(II) →CP-[Cu(I)]4+4Fe(III)，CP-[Cu(I)]4+O₂+4H⁺→CP-[Cu(II)]4＋2H₂O，在阻断铁/铜介导的脂类过氧化和OH生成中起了重要作用。这三种抗氧化蛋白占了人血浆蛋白的4％。此外还有金属硫蛋白（MTs），是一类低分子量的富含半胱氨酸的金属结合蛋白，从细菌到人均广泛存在，可以结合铜、锌、镉、汞，防止重金属中毒。MTs基因还能受ROS的诱导而增强表达。

    其它如尿酸、卵巯基蛋白C等也具有生物抗氧化的功能。所有这些抗氧化剂并非各自独立的，而是形成了一个彼此联系、相互协同的网络。例如生育酚和β-胡萝卜素在生物膜上协同作用，阻止脂类的过氧化；生育酚和抗坏血酸联合作用则有效阻止人低密度脂蛋白的氧化。

1.2.4 抗氧化剂的回复
     被氧化的抗氧化剂通过各自相应的途径还原再生。

    生育酚自由基在抗坏血酸作用下重新生成生育酚。在植物的叶绿体、液泡、根瘤中，存在着抗坏血酸氧化态（抗坏血酸自由基、DHA）的回复酶系：DHA还原酶，以GSH为氢供体，催化DHA回到抗坏血酸；抗坏血酸自由基还原酶，以NADPH为辅酶，催化回到抗坏血酸。已有足够证据表明动物中也存在DHA还原酶。

    更重要的是GSSG和氧化态Trx的回复。GSSG通过谷胱甘肽还原酶（GR，2mer，EC 1.6.4.2），以NADPH为辅酶，还原回到GSH：GSSG＋NADPH＋H^＋→2GSH＋NADP^＋。GR是一种起源极古老的酶，活性部位的基因序列分析表明人GR可能起源于紫细菌，经线粒体遗传至今。人和大肠杆菌的GR有55％同源，是很少见的真核/原核之间的高同源性。哺乳动物中组织分布为肝最高，其次是心、肺、肾和红细胞，仅仅限于胞浆和线粒体中。氧化了的Trx则被硫氧还蛋白还原酶（TR）所还原。TR类似于前文提到的GPOX，也是一种罕见的含硒酶，它利用NADPH作为氢供体来还原Trx的二硫键。