细胞内环境的氧还调节和氧还因子-1(Ref-1)的研究进展（二）

细胞内环境的氧还调节和氧还因子-1(Ref-1)的研究进展

博士生: 严明达
导 师: 郑仲承 研究员

中 国 科 学 院
上海生命科学研究院
生物化学和细胞生物学研究所

（续前）

1.3 氧还调节的靶蛋白
1.3.1 ROS的靶蛋白
    除了负面的损伤作用，活性氧也积极参与对细胞信号传导的调控。首先要讨论的是活性氧的靶蛋白。细胞中活性氧在被调控蛋白上作用的靶点主要是半胱氨酸残基的巯基（RSH），巯基易被氧化成次磺酸 (RSOH)、亚磺酸 (RSO₂H)，直至磺酸 (RSO₃H)。但由于胞内抗氧化剂，尤其是各种巯基抗氧化剂的存在，当活性氧进攻巯基生成RSOH后，另一个巯基加入反应，生成二硫键（RSSR）。二硫键又可在GSH、Trx等抗氧化剂作用下恢复为巯基。而若是抗氧化剂工作不利，RSOH就有可能进一步氧化为RSO₂H、 RSO₃H，形成不可回复的受损蛋白。这些过程可参见图1-2。

    通常认为蛋白处于RSH态时为活性态，而氧化为RSSR等就会引起失活。但也不可一概而论，蛋白质的活性还要取决于其空间构象，破坏其活性态的构象就破坏其活性的发挥。如果活性态时需要适当的二硫键，那么活性氧的加入就会促进其活力，反之过分的还原将导致其失活。事实上，处于细胞信号途径中的信号蛋白更是受到诸多因子的影响，蛋白-蛋白相互作用会使问题更加复杂化。例如表面上活性氧激活了某个酶，但却可能是抑制了其负调蛋白的间接结果。
表1-1列出了ROS的靶蛋白种类及其调节效应，下面就其中部分作讨论。

表1-1. 活性氧对细胞信号分子的影响

信号分子	氧化作用下
1.蛋白质酪氨酸激酶EGF受体，胰岛素受体，PDGF受体，Src, Lck, Fyn, ZAP-70, Syk, Lyn, Fgr, Hck, Btk, Ltk	激活
2.蛋白质酪氨酸磷酸酶	失活
3.蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶MAPK，JNK，p38, BMK1, Akt, S6激酶PKC	激活
4.蛋白质丝氨酸/苏氨酸磷酸酶PP1， PP2A, 钙调磷酸酶	失活
5.小G蛋白Ras	激活
6.脂类信号通路PLC，PLD，PLA2，PI 3-激酶	激活
7.Ca2+通路肌醇三磷酸受体，ryanodine受体，Ca2+-ATPase, Ca2+/Na+交换蛋白	激活
8.转录因子AP-1(c-Fos, c-Jun), NF-κB(p50, Rel), USF, TTF-1, GR, BRV1E2, NFI, Myb, NF-Y, p53, PEBP2/AML, Oct-2, Egr-1, BZLF1, Ets, GABP, Ah受体, ATF, CREB, Ku	失活

    蛋白酪氨酸激酶（PTK）可分为受体型（RTK）和非受体型。RTK如胰岛素受体，在结合配体后激活，磷酸化其本身和胰岛素受体底物-1（IRS-1）(Heldin, 1995)。而氧化剂如过氧化氢、钒酸盐、过钒酸盐，也可以产生类胰岛素效应，导致细胞代谢、增殖(Hayes et al., 1987; Heffetz et al., 1990)。这正是通过活性氧激活胰岛素受体RTK活性所至。同样，过氧化氢、UV、巯基烷化剂碘乙氨（IAA）可诱导EGF受体、PDGF受体的磷酸化(Pawson 1995; Heldin 1995; Schlessinger et al., 1992)；过氧化氢还导致Shc-Grb2-Sos复合物与EGF受体的聚合，传递下游信号(Rao, 1996)。其他非受体型的PTK也可以被氧化剂激活。B细胞中过氧化氢可活化Syk —— 一个在B细胞受体介导的信号通路中的关键激酶；中性粒细胞中，氧化刺激激活的PTK有Lyn、Fgr、Hck、Btk以及Syk； 跨膜的PTK如Ltk亦可被IAA、二酰胺所增强；T细胞中过氧化氢、过钒酸盐、UV等可以激活包括Lck、Fyn、ZAP-70(70kD的T细胞受体ξ链相关蛋白) 在内的诸多PTK。应该注意到的是，UV诱导的ZAP-70依赖于CD3(T细胞受体组分)和CD45(一个跨膜的蛋白酪氨酸磷酸酶)，而过氧化氢诱导的ZAP-70磷酸化不依赖CD45(Schieven et al., 1994)。说明虽然同属氧化刺激，但也有着不同的信号转导通道。

    具体机制上，目前为止无证据表明氧化剂激活PTK是直接的作用。而相反，蛋白酪氨酸磷酸酶（PTP）在氧化剂作用下的失活可以说是直接的结果，因为几乎所有的PTP的催化活性部位都有活性半胱氨酸, 在催化中形成巯基-磷酸中间物(Fialkow et al., 1994; Fischer et al., 1991)，因此氧化会直接导致其失活。胞内磷酸化水平由PTK、PTP共同决定，故氧化剂导致的磷酸化增强有可能就是PTP失活的间接结果。

    蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶的例子有著名的MAPK级联、Akt激酶、蛋白激酶C等。过氧化氢可激活的MAPK家族激酶有c-Jun N端激酶（JNK）、p38 MAPK、大MAPK1（BMK1）等(Aikawa et al., 1997; Guyton et al., 1996; Abe et al., 1996)。有趣的是，蛋白磷酸酶CL100（可以将MAPK去磷酸化）也可被氧化应激所诱导表达，说明ROS诱导的MAPK活化存在着负反馈(Keyse et al., 1992)。Akt是含pleckstrin同源功能域的丝氨酸/苏氨酸激酶，由生长因子通过PI-3激酶（PI-3K）激活。过氧化氢的刺激可以导致Akt激活，并同时诱导热击蛋白Hsp27磷酸化，发生两者的结合(Konishi et al., 1997; Huot et al., 1997)。Akt的激活也不是蛋白氧化的直接结果。由于Hsp27的磷酸化是MAPK激活的蛋白激酶-2（MAPKAPK-2，由p38所激活）所为，而体外实验又表明MAPKAP-2可以磷酸化Akt，所以有理由猜测过氧化氢激活了MAPKAP-2，进而磷酸化Akt和Hsp27。至于PKC的氧还调控则更为复杂。过氧化氢刺激的细胞中有PKC的激活，且似乎是蛋白氧化的直接后果。因为用纯化的PKC研究表明，其N端调节域中存在选择性的氧化修饰，可以激活PKC活性；但相反，其C端的氧化修饰则导致其彻底失活; 在高碘酸作用下，低浓度时激活而高浓度则失活(Gopalakrishna et al., 1987, 1989, 1991)。因而PKC的氧还调节有其双重特性。此外，氧化型二酰甘油(DAG)可刺激PKC活性，所以活性氧也可以通过脂类氧化间接活化PKC(Takekoshi et al., 1995)。

    同样，蛋白丝氨酸/苏氨酸磷酸酶也存在氧还调节。体外研究表明蛋白磷酸酶1和2A的巯基氧化可抑制其酶活(Nemani et al., 1993)。晶体研究表明钙调磷酸酶的活性中心含有Fe和Zn(Griffith et al., 1995; Kissinger et al., 1995)。SOD无论在体内或体外均能防止钙调磷酸酶的失活，表明Fe-Zn活性中心的氧化可导致失活(Wang et al., 1996)。

    Ras是一种小G蛋白，传递从某些RTK到MAPK途径的信号。氧化应激如NO可结合于Ras分子表面的Cys118残基，导致其激活(Lander et al., 1995，1996，1997)。

    脂类代谢中的磷脂酶和磷脂激酶也是细胞信号系统的重要组成。过氧化氢、过钒酸盐可诱导PLCγ的磷酸化，产生IP3和DAG（Bianchini et al., 1993; Blake et al., 1993）。这种激活是否属于直接氧化激活还有待研究，至少在EGF诱导的PLCγ活化过程中，过氧化氢通过间接的酪氨酸磷酸化增强PLCγ活性(Bae et al., 1997)。氧化剂还可激活PLA2和PLD(Tournier et al., 1997; Natarajan et al., 1993, 1996)。 通常PLA2的激活由PKC、或小G蛋白Rac、或两者一起所介导，但过氧化氢的激活机制尚不清楚；而氧化剂诱导的PLD激活可能与PTK和Ca2+相关。T细胞经巯基氧化剂处理可诱导PI3-K和Lck结合而激活；静脉注射过钒酸盐导致大鼠肝脏中PI3-K和IRS-1结合而激活。

    Ca2+信号转导方面，上文提到的PLCγ所生成的IP₃可结合于内质网等胞内钙库膜上的IP3受体/Ca2+通道，引起钙释放而升高胞浆的Ca2⁺离子水平。氧化剂也可诱导胞内钙流而升高胞内钙离子水平，如GSSG可促进透化肝细胞中钙从IP₃敏感的Ca2⁺库中的释放(Missiaen et al., 1991)。这一过程与IP₃的生成相关，且可被PTK抑制剂herbimycin A所抑制(Schieven et al., 1993; O’Shea et al., 1992)，在不表达Syk或Lyn的突变细胞株中也部分抑制(Qin et al., 1997)，提示氧化剂激活的钙信号实际上还是通过了上游的磷脂酶和激酶途径。但其他的研究表明IP3受体本身也有氧还调节。tert-丁基过氧化氢物可在无IP₃生成的情况下导致胞内钙迁移(Rooney et al., 1991)；用纯化蛋白作的研究表明硫柳汞(巯基氧化剂，用作消毒防腐药)可直接作用于IP₃受体，增强其与IP₃的亲和力(Kaplin et al., 1994)。相类似的，其他钙通路里的离子通道如ryanodine受体、Ca2⁺—Na⁺交换通道也受氧还状态调节。

    转录因子更是重要的氧还调节对象，往往因氧化而丧失DNA结合能力。具体将在后面叙述。

1.3.2 NO的靶蛋白
    生物体内NO与氧分子、超氧化物（O₂^-）、过渡态金属反应，分别生成NOx、过氧亚硝酸根（OONO^-）、金属-NO加成物，并进一步在亲核中心作加成亚硝酸化反应(Stamler, 1992; Mohr et al., 1994)。巯基是生物体内普遍存在且十分活跃的亲核中心，故主要为S-亚硝基巯基的形成。可表示为：

    因此，含金属或巯基的蛋白往往就是NO的靶蛋白。表1-2罗列了位于胞内各处的NO靶蛋白。其中NO进攻线粒体电子传递链复合物I/II和乌头酸合成酶中的[4Fe4S]中心，是炎症细胞因子导致的细胞代谢混乱的原因之一(Henry et al., 1993)。除了这些病理作用，NO的靶蛋白也正是组成NO响应通路上的各种信号传递蛋白。许多含血红素的蛋白如鸟苷酸环化酶就表现出明显的NO响应性。当鸟苷酸环化酶与NO结合后，会发生变构而活化（类似于O₂与血红蛋白的结合）。在正常生理活动中，从血管内皮细胞中释放的NO可以扩散进入血管平滑肌细胞，激活其胞浆鸟苷酸环化酶，从而导致血管舒张。同时也可扩散进入血小板细胞，阻止血小板聚集。（有趣的是，NO并不能从活化的血小板细胞中释放，说明其扩散并非没有限制。）另一方面，活性氮本来就是活性氧家族的成员，它们往往与其他活性氧协同调控细胞的信号系统。仍以血管平滑肌细胞为例，松弛细胞中相对的还原环境可以使之通过鸟苷酸环化酶的铁中心响应NO信号，维持血管的松弛。而一旦细胞被收缩相关的信号激活，O₂^-生成，与NO反应生成OONO^-，就引导NO转向新的巯基靶点，细胞结束松弛。可见这个过程中NO/O₂^-的平衡比例可起关键的调节作用。
此外与上文提到的活性氧类似，NO也可以激活G蛋白(Lander et al., 1993)、离子通道(Bolotina et al., 1994)，及影响氧还敏感的蛋白激酶(Gopalakrishna et al., 1993)、转录因子(Peunova et al., 1993; Lander et al. 1993)等，将化学信号转化成细胞信号，参与信号传递。在此不再一一列出。

表1-2. NO的靶蛋白

反应位点	细胞定位
	膜	胞浆	核	胞外
巯基	NMDA受体Kcz＋通道NADPH氧化酶p21/ras蛋白激酶C腺苷酰环化酶（I）BM-SH	GAPDHSNAP-25GAP-43组织纤溶酶原活化蛋白醛缩酶醛还原酶γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶肌动蛋白谷胱甘肽	AP-1NF-κBOMDM转移酶	谷胱甘肽白蛋白
金属		鸟苷酸环化酶血红蛋白乌头酸酶/IRE-BP氧还酶复合物I/II环氧化酶类2，3-吲哚胺双氧化酶细胞色素P450NO合成酶	SoxRS
？		核糖还原酶	CREB

1.4 细胞信号通路和细胞氧还状态间的对话
1.4.1 对话是存在的
    据上所述，细胞信号通路受到氧还调控，反过来，胞内氧还状态是否受到细胞信号通路系统的调节呢？答案是肯定的。事实上也容易了解，因为本文开头所介绍的活性氧的胞内来源均是细胞正常生理所必须的酶类，这些酶势必会受到细胞信号通路的调控，进而影响胞内活性氧的数量与种类，改变细胞氧还状态。例如氧化剂激活PLA₂，PLA₂作用产生信号分子花生四烯酸（AA），AA则活化NADPH氧化酶，促进了胞内ROS的生成，形成了使信号增益的正反馈；又如H₂O₂及亚油酸氢过氧化物在很多细胞中可激活PLD活性，而N-甲酰-Met-Leu-Phe在中性粒细胞中正是以PLD依赖的方式诱导H₂O₂的产生并释放。

1.4.2 ROS第二信使学说
    细胞信号通路和细胞氧还状态间对话的“使者”自然就会是在活性氧分子了。鉴于外界刺激在信号传递过程中可以导致ROS的产生、而ROS又可以刺激信号通路，就提出了ROS作为细胞信号系统中第二信使的假设。近年来的研究表明在某些细胞信号途径中此假设是成立的，因为实验数据表明这些外界刺激的确导致了ROS的产生，氧化剂的刺激可以部分模拟外界刺激信号，而且用还原剂阻断ROS则可以衰减细胞的响应。说明ROS在这些信号系统中充要地行使了第二信使的角色。表1-3列出了已知的ROS作为第二信使的细胞信号系统。

    转化生长因子β（TGFβ）在细胞调节细胞生长和分化中有多重功能。小鼠成骨细胞、人肺成纤维细胞中TGFβ可诱导H₂O₂的生成。成骨细胞中，TGFβ、H₂O₂都可以将细胞阻断在G1晚期，而CAT酶可以部分地打破这种细胞周期停滞。TGFβ诱导的egr-1基因的表达也可被NAC、吡咯烷二硫代氨基甲酸酯(PDTC)、CAT酶等氧化拮抗剂所阻断。

    碱性成纤维细胞生长因子（βFGF）也导致ROS的生成，这一作用可被NADPH氧化酶的抑制剂diphenyleneiodonium（DPI）阻断（事实上NADPH氧化酶产生的ROS还参与其他许多细胞信号系统，如乳糖基酰基鞘氨醇,TNFα，IL-1等）。随同ROS生成的阻断，βFGF诱导的c-fos的表达也被DPI所阻断。

    Baeuerle等发现由众多刺激，如双链RNA、钙离子载体、TNFα、PMA、IL-1、LPS、凝集素、CHX等，所激活的NF-κB均可被NAC、PDTC、Trx等抗氧化剂所抑制，因此认为ROS是NF-κB活化中普遍需要的信号分子。其他系统中也有同样的发现，如巨噬细胞Fc.

表1-3. ROS作为第二信使的细胞信号系统

刺激信号	细胞类型	下游响应	文献
TGFβ	成骨细胞	egr-1,细胞周期停滞	Ohba et al., 1994  Thannickal et al., 1995
βFGF	软骨细胞	c-fos	Lo et al., 1995
TNFα	软骨细胞	JNK, c-fos, c-jun	Lo et al., 1995 and 1996
IL-1	软骨细胞	JNK, c-jun	Lo et al., 1996
PDGF	平滑肌	MAPK DNA合成，趋化性	Sundaresan et al., 1995
乳糖基酰基鞘氨醇	平滑肌	Ras, MAPK	Bhunia et al., 1997
PMA	巨噬细胞	酪氨酸磷酸化 PLA2	Zor et al., 1993
Fcγ2a	巨噬细胞	NF-κB	Muroi et al., 1994
CD28	T细胞	NF-κB, IL-2 gene	Los et al., 1995
LPS	髓样白血病细胞	NF-κB, HO gene, c-fos, c-jun	Kurata et al., 1996
EGF	A431	酪氨酸磷酸化 EGF受体，PLCγ	Bae et al., 1997
LPA	HeLa	MAPK	Chen et al., 1995

    γ2a受体的激活就导致ROS的产生并伴随NF-κB的活化；T细胞上CD28的刺激也导致ROS的生成、NF-κB的活化，并转录表达IL-2基因。但也有相矛盾的报道，如COS-1细胞中一过性表达过氧化氢酶并不能影响TNFα及PMA诱导的NF-κB的激活；而且也并非所有细胞中加入H₂O₂都能激活NF-κB。因此说，ROS起第二信使的功能是有细胞专一性的。