细胞内环境的氧还调节和氧还因子-1(Ref-1)的研究进展（五）

细胞内环境的氧还调节和氧还因子-1(Ref-1)的研究进展

博士生: 严明达
导 师: 郑仲承 研究员

　

中 国 科 学 院
上海生命科学研究院
生物化学和细胞生物学研究所

（续前）

2.3 基因与表达调控

2.3.1 染色体定位与基因线性结构

    人Ref-1基因定位于第14号染色体长臂11.2-12区 (Harrison et al., 1992; Robson et al., 1992; Zhao et al., 1992)。其结构示于图2-5。完整的转录区全长约2.6kb，包括4个内含子和5个外显子，它们的分界处符合GT/AG规律。其中翻译起始ATG位于第二外显子，终止码位于第五外显子。启动子区无TATA box，而有CCAAT box，以及一个CpG岛。基本启动子区约300bp。CpG岛以及第一外显子中具有多个可能的转录因子结合位点，如Sp1、USF、AP-1、CREB、ATF等(Akiyama et al., 1994; Harrison et al., 1995; Robson et al., 1992; Zhao et al., 1992)。再上游有三个可能的钙响应负调元件，一个属A型（nCaRE-A）、两个属B型（nCaRE-B）。 缺失nCaRE-A对启动子活性影响不大，说明并不重要。真正起作用的是nCaRE-B2，Ref-1能协同钙响应负调元件结合蛋白（nCaREB）结合其上，构成表达产物的负反馈调控(Izumi, et al., 1996)。事实上，Ref-1也能结合在旁甲状腺素（PTH〕启动子的nCaRE位点，抑制其转录(Okazaki et al., 1994; Chung et al., 1996)。

图2-5. 人Ref-1基因示意

    小鼠的APEX也在14号染色体上，位于C3区。尽管人、小鼠的编码区十分同源，但启动子以及内含子区同源性相对较低。小鼠细胞中人Ref-1启动子的活性仅为小鼠的1/5，表现出种属差异（Harrison et al., 1997）。

2.3.2 基因的单核苷酸多样性

    近年来的研究表明人DNA修复相关基因中单核苷酸多样性（SNPs）及由此导致的氨基酸替代点突变比较普遍(Shen et al., 1998; Mohrenweiser et al., 1998)。在Ref-1方面，Hadi et al.随机抽取了128人的Ref-1基因(Genomics DNA经PCR扩增出Ref-1的外显子)，重新测序，发现有7种氨基酸点突变体。其中L104R、E126D、R237A会使Ref-1的Ape活性下降40-60%，D283G（以及以前发现的D283A）仅有10%活性；而G306A和发生频率最高的D148E对Ape活性基本无影响；G241R的突变则使Ape活性有所上升(Hadi et al., 2000)。

2.3.3 诱导表达

    尽管Ref-1基因的启动子区没有TATA box，而有类似看家基因的特征，但近年来的研究表明Ref-1的表达还是可以被胞外刺激所诱导而增强（表2-1）。

表2-1. Ref-1基因的诱导表达

组织/细胞	刺激/处理	mRNA	蛋白水平	APe活性	文献
HT-29 细胞	低氧	↑-N	↑-W		Yao et al., 1994
HeLa 细胞	低氧		↑-W		Walker et al., 1994
大鼠齿状脑回颗粒细胞	缺血	↑-I, N	↑-IHC		Gillardon et al., 1997
大鼠海马CA1神经元	缺血	↑-I, N	NC, then ↓		-IHC Gillardon et al., 1997
大鼠海马	缺血		↓-W		Edwards et al., 1998a
CHO 细胞	ROS	↑-N	↑-W	↑	Grosch et al., 1998
HeLa S3 及 WI38细胞	ROS	↑-N	↑-W	↑	Ramana et al., 1998
B 淋巴细胞	ROS		↑-W, IHC		Tell et al., 2000
猪真皮组织	创口愈合	↓, then ↑-I			Harrison et al., 1996
大鼠间皮细胞	石棉	↑-N	↑-W	↑	Fung et al., 1998
小鼠CTLL-2细胞	IL-2	↑-N			Lu et al., 1996
FRTL-5细胞	促甲状腺素	↑-N	↑-W		Asai et al., 1997
MA-10细胞	人绒毛膜促性腺激素	↑-N			Suzuki et al.,1998
大鼠SON及PVN核细胞	高渗	NC-I			Rivkees et al., 1994
大鼠SCN核细胞	光	NC-I			Rivkees et al., 1994

    首先是低氧、缺血或直接的氧化剂所造成的氧还刺激，可以导致Ref-1转录、翻译的上调，增强细胞对H2O2、MMS、博来霉素、γ射线等的抵抗能力。从DNA损伤修复角度看，活性氧增加会对DNA产生损伤，而AP核酸内切酶正是ROS损伤修复过程中的限速酶，因此Ref-1的诱导可视作一种补偿机制。同时从细胞氧还平衡的角度看，Ref-1的上调对氧化敏感的各类转录因子也起着积极的促进作用。这方面还将在后面予以详述。

    其他胞外诱导因素有石棉(胸膜细胞in vivo)、促甲状腺素（大鼠甲状腺FRTL-5细胞）、人绒毛膜促性腺激素（小鼠Leydig细胞）、以及我们实验室发现的IL-2刺激（小鼠CTLL-2细胞）。此外还有一些负结果，如高渗刺激并不能在受渗透压调控的大鼠视丘下部视束上核及室旁核中诱导Ref-1，控制光照改变生理钟节律也不影响视交叉上核中Ref-1的mRNA水平。

    蛋白的诱导表达、尤其是mRNA上调的主要机制来自Ref-1基因启动子区的响应元件及相应的转录因子，但这方面尚不明了。仅有证据表明受H2O2诱导表达时依赖于Ref-1启动子上的CRE元件(Grosch et al., 1999)。

2.4 组织分布与亚细胞定位

    起先人们认为Ref-1到处都有均一的表达，但随着研究的逐步深入，越来越多的事实证明Ref-1有着复杂的、不均一的组织分布。如原位杂交表明，尽管Ref-1在大鼠脑部的海马区域普遍有转录，但更集中于视交叉上核、视束上核和室旁核中(Rivkees et al., 1994; Wilson et al., 1996)。免疫组化指出人脑中Ref-1蛋白集中于海马的齿状脑回以及CA2、CA4区域(Duguid et al., 1995)。

    Ref-1于细胞内的定位，在众多培养细胞里观察到的是集中于细胞核内，这可以用其N端的核定位序列来解释，也与其功能相匹配。但体内研究结果表明，除了定位于核内，Ref-1在有些细胞中却是大部分、甚至完全在胞质中，如巨噬细胞、精母细胞、海马细胞、肝细胞、舌下运动神经元和乳腺细胞(Duguid et al., 1995; Kakolyris et al., 1998; Rivkees et al., 1994; Wilson et al., 1996)。考虑到Ref-1的多功能性，作为DNA修复酶，就有可能在胞浆线粒体中起DNA修复作用(Sawyer et al., 1999)；或者作为氧还因子，可能维持新合成的转录因子在入核之前就处于还原态(Kakolyris et al., 1998)。从细胞生理上看，这些细胞均具有旺盛的代谢和分裂，Ref-1的胞质定位可能与胞内升高的氧化刺激有关，尤其是巨噬细胞中。此外，舌下运动神经元中还发现Ref-1聚于核糖体上(Duguid et al., 1995)，是不是提示着什么新功能呢？有趣的是，果蝇的核糖体蛋白PO和S3被发现具有DNA修复酶活性，既位于核糖体上也位于核内(Lutsch et al. 1990)。

    纵然在核中，Ref-1也并非是均匀的分布。卵巢基质细胞、表皮细胞、肾上腺髓质细胞、宫颈基底细胞、副甲状腺腺体上皮细胞、以及人小脑、海马、脑干的核染色表明，Ref-1相对聚于染色质上(Duguid et al., 1995)。表皮细胞核中的Ref-1也有不均一的定位，且会随同细胞的形态变化如角质化而变化(Duguid et al., 1995)。

    同时位于胞质和核中的细胞有：肾上腺皮质细胞、小脑Purkinje细胞、一些宫颈细胞、肺细胞、胃的腔壁及粘膜细胞等(Kakolyris et al., 1998; Rivkees et al., 1994)。

    事实上，在胞外刺激下，Ref-1还会发生从胞浆到核内的核转位行为。如氧化刺激下的B淋巴细胞，Ref-1转位在1小时内迅速完成(Tell et al.,1998)，而HeLa、大鼠齿状脑回细胞中这一过程会持续数小时之久(Gillardon et al.,1997; Ramana et al., 1998)；促甲状腺素刺激下的大鼠甲状腺细胞也发生Ref-1的转位 (Tell et al., 2000)。而且往往在转位以后，才有前面提到的Ref-1 de novo诱导合成。

    Kakolyris et al.还发现，即使是同一组织的同一类细胞，Ref-1的分布也会有不同的细胞亚群，例如小脑粒细胞大部分是胞质染色的，但也有部分细胞却集中于核(Kakolyris et al., 1998)。

2.5 翻译后修饰

    早年在生化研究中纯化得到的Ref-1几乎总具有完整的AP核酸内切酶活性，使人们并不在意它的翻译后修饰。但随着Ref-1在细胞生物学等方面功能的研究深入，翻译后修饰也就成为Ref-1研究领域的一大部分。目前发现的Ref-1翻译后修饰有磷酸化修饰和氧还修饰两大方面。

    有两篇报道(Fritz et al., 1999; Yacoub et al., 1997)提到Ref-1蛋白具有多个可能的酪蛋白激酶I（CK I）、II（CK II）、蛋白激酶C（PKC）磷酸化位点，但由于对保守区域的不同认识，这两篇报道的预测有很大不同。Yacoub经四种不同的算法、以及点突变验证的预测可能更可靠些。功能上，Fritz报道CK II的磷酸化不影响DNA修复功能，而激活对AP-1的氧还调节功能，尽管CK II识别的磷酸化序列并不在分子的氧还功能域中；但相反的，Yacoub的结果指出CK II磷酸化会导致DNA修复功能的丧失，而CK I、PKC无影响。这些结果概括于图2-6。

图2-6. Ref-1蛋白的磷酸化修饰

    氧还修饰是指硫氧还蛋白（Trx）可以与Ref-1相互作用形成异源二聚体，还原Ref-1(Hirota et al., 1997; Qin et al., 1996; Ueno et al., 1999)。 两者的相互作用发生在Trx催化活性中心的Cys32和Cys35残基(Hirota et al., 1997)，而Ref-1方面的作用位点尚不知，可能是氧还敏感的Cys65和Cys93(Walker et al., 1993, 1994; Xanthoudakis et al., 1994)。功能上看，Trx的还原作用可增强Ref-1对AP-1、p53 DNA结合活性的增强作用(Hirota et al., 1997; Ueno et al., 1999)。由于Ref-1大多集中于细胞核中，Trx首先需要转位入核，这一过程是Trx与Ref-1相互作用及随后对AP-1激活的关键。许多刺激可促使Trx的转位，如UV(Masutani et al., 1996)、H2O2(Makino et al., 1996)、佛波酯(Hirota et al., 1997)、cis-diamminedichorolatinum(II) (CDDP)( Ueno et al., 1999)等。这表明了细胞氧还调控存在级联事件。而Ref-1的DNA修复功能是否受其氧还状态影响尚未知。