以免疫球蛋白为载体的抗O型口蹄疫病毒基因工程疫苗的构建

«生物工程学报»2000年11月16卷6期

赵  凯  陈光辉  张震宇  严维耀  郑兆鑫
(复旦大学生命科学院遗传工程国家重点实验室，上海  200433)

摘  要  以自体免疫球蛋白作为外源抗原的载体来研制疫苗是一条研制安全、高效疫苗的新途径。将猪IgG H链基因中的CDR3区缺失，剩余的两个片段分别连接到pBluescript II SK(+)上，其中一片段再与编码FMDV VP1两个拷贝的141~160位氨基酸残基和一个拷贝的200~213位氨基酸残基构成的串联片段20AA~14AA~20AA的核苷酸片段相连。然后将它们切下与质粒表达载体p^ET_28b相连，构建出融合表达质粒p^ET_28b-FH，经限制酶酶解及DNA序列分析证明该融合基因各连接点及读框正确。转入大肠杆菌BL21(DE3)plyS表达出一分子量为64kD的蛋白质。经ELISA检验证明，大肠杆菌细胞中表达的融合蛋白有O型FMDV抗原活性。将该融合蛋白肌肉注射免疫豚鼠和猪，攻毒实验表明，疫苗p^ET_28b-FH对豚鼠产生了保护作用，保护率为66%，对猪也有保护作用。

关键词  FMDV，基因工程疫苗，自体免疫球蛋白，猪的IgG H链

中图分类号  Q78    文献标识码  A    文章编号  1000-3061-(2000)06-0679-05

    口蹄疫病毒病是一种高度传染性的家畜病毒性疾病，对畜牧业有极大的危害。研究新型的安全、有效的遗传工程疫苗，控制该病流行是一项极为重要的研究方向。随着对口蹄疫病毒的分子免疫学研究的深入发展，发现VP1蛋白的141~160位和200~213位氨基酸序列是决定口蹄疫病毒免疫原性的主要抗原决定簇片段。郑兆鑫^[1]构建重组质粒pXZ500，其中含有编码O型口蹄疫病毒外壳蛋白中141~160位氨基酸和200~213位氨基酸的串联基因，并证明该基因在大肠杆菌细胞中表达的抗原蛋白具有很强的免疫原性，可作为抗O型口蹄疫病毒的疫苗。为了构建这种基因工程疫苗，增强免疫原性，必须将抗原决定簇与大分子的载体蛋白相连。但是，用作载体的蛋白如果选择不当可能会对动物产生毒性。因此，Bona^[2]提出用自体蛋白作为外源抗原的载体蛋白来研制疫苗。在自体蛋白中，IgG H链分子最为理想：(1)由于IgG H链FC片段具有APC受体作用，可以专一性地被不同APC所摄取；(2)取代CDR3区的外源片段，可以暴露于IgG H链分子的表面；(3)IgG在体内半衰期长达2~3周，另外，如用免疫动物的自体IgG H作为载体蛋白，因其是自体蛋白，一般对自体不会产生免疫排斥反应，不影响疫苗的重复使用。因此，用自体IgG H作为外源抗原的载体来研制疫苗，不仅高效而且安全。为了提高疫苗的免疫原性，我们改用猪IgG H链蛋白作为载体，与口蹄疫病毒(Food-and-Mouth Virus)VP1中两个拷贝的141~160位氨基酸残基和一个拷贝的200~213位氨基酸残基构成的串联片段20AA~14AA~20AA相连接使其取代猪IgG H链的CDR3区构成融合蛋白疫苗。以豚鼠和猪作为动物模型来研究该疫苗的免疫效果，为研制高效安全的抗口蹄疫病毒的基因工程提供依据。

1 材料与方法

1.1  材料

1.1.1    动物、病毒株及质粒：豚鼠购自第二军医大学实验动物中心。动物实验用猪系长白猪，购自甘肃省武威地区。口蹄疫病毒为O型毒株。质粒pBS-SH(含猪全长IgG H链基因，参见文献[3]，pXZ500(含与大肠杆菌β-半乳糖苷酶融合的O型FMDV VP1抗原决定簇串联片段20AA~14AA~20AA，见文献[1],pBluescript II SK(+),pBLUESCRIPT II KS(+)和p^ET_26b-FH和大肠杆菌XL-1 blue cell,JM109和BL21(DE3) plysS等均为本实验室保存。

1.1.2    限制酶及其它试剂：均购自华美生物工程公司， Promega公司，Bio-Lab公司和Boehringer Mannheim公司。标准O型FMDV抗原和O型FMDV标准阳性血清为兰州畜牧兽医所提供，羊抗豚鼠HRP-IgG为Sigma公司产品。

1.2  材料

1.2.1    DNA操作：基本上参照文献[4]。

1.2.2  基因表达：基本上参照文献[4]。

1.2.3  斑点ELISA试验：基本上参照文献[5]。

1.2.4  攻毒试验：按常规方法制备疫苗。取8周龄豚鼠，股内侧肌肉注射0.25mL含400μg p^ET_28b-FH融合蛋白，2周后同样途径加强1次，对照组不作免疫。第一次免疫后6周用0.2mL 100ID₅₀的口蹄疫病毒攻击。2周内观察豚鼠发病情况。猪的攻毒实验采用无病毒感染的甘肃长白猪，体重约20kg。免疫2次，第一次免疫剂量为3mL含1.5mg p^ET_28b-FH融合蛋白，二周后再以相同剂量增强一次。第一次免疫后63d用2mL 50ID₅₀的口蹄疫病毒攻击，2周内观察猪的发病情况。

2 结果

2.1  表达质粒pET28b-FH的构建

2.1.1  PCR扩增DNA片段：PCR用Tag plus II酶从质粒pBS-SH上扩增出片段I和片段III，扩增引物分别为：P₁⁺5'GCG ACG CGT TCT TGC ACA GTA ATA GCG3'(5'端含Mlu I位点)和P₂^-5'GTA ATA CGA CTC ACT ATA GG3',P₃⁺5'CTT TTT AAA TGG GGC CCA GGC GTT GAA GTC3'和P₄^-5'GCG CAA TTA ACC CTC ACT AAA GG3'。片段I长438bp，含有已缺失了的CDR3的IgG H链的V区。片段III长1130bp，含有IgG H链的J区和C区。从质粒pXA500上扩增出片段II，扩增引物为P₅⁺5'GCG ACG CGT ATG GTA CCA AAC CTG CGT G3'(5'端含有Mlu I位点)和P₆⁺5'CGG GAT CCT GGC AGA GTA CGA GCA AC3'(5'端含有BamH I位点)。产物为2个，大片段称之为片段II，长211bp，含有FMDV VP1免疫活性肽串联基因(20AA~14AA~20AA)。小片段长78~86bp，只含一个20AA肽段基因。因PCR扩增DNA所用的酶为混合酶，除了Tag酶外，还有一种3'-5'的外切核酸校正酶，因而片段I、II、III大部分为平端。

2.1.2  表达质粒p^ET_28b-FH的构建：将PCR产物片段I用HindIII酶切，分离出384bp的IgG H链V区片段(缺少CDR3区)，插入到pBS-SK的Hind III和EcoR V位点，构成重组质粒pBS-SK-I。将片段II用Mlu I和BamH I酶切，分离出200bp的片段(含有FMDV VP1免疫活性串联片段20AA~14AA~20AA核苷酸序列)，插入到质粒pBS-SK-I上，片段I上游的Mlu I和BamH I位点，将片段I和片段II连接起来，构成重组质粒pBS-SK-I-II。再将片段III用EcoR I酶切，分离出1035bp含IgG H链完整J和C区的片段，插入到pBS-KS的EcoR I和Sma I位点将片段III方向调整与片段I+II的方向一致，同时利用载体pBS-KS Sma I下游的BamH I位点，这样构成重组质粒pBS-KS-III。最近用BamH I和Hind III酶切重组质粒pBS-SK-I-II，分离出片段I+II，用Xho I和BamH I酶切重组质粒pBS-SK-III，分离出片段III，将片段I+II和片段III与Hind III和Xho I酶切的表达载体p^ET_28b-FH一起共同组建表达载体p^ET_28b-FH，如图1。该表达质粒的启动子为T71ac，启动子下游为融合抗体基因FH，长1644bp。它由三部分组成，前面部分为猪IgG H链的V区(缺少CDR3)，中间部分为已取代IgG H链CDR3区的FMDV VP1免疫活性片段20AA~14AA~20AA的核苷酸序列，后面部分为IgG H链的J+C区。

2.1.3  表达质粒p^ET_28b-FH的鉴定：用限制酶酶切分析证明各片段已正确连接到质粒p^ET_28b上，部分序列分析证明质粒p^ET_28b-FH上各片段连接位点正确，融合基因读框正确。

2.2  FMDV的VP1蛋白中串联免疫活性肽基因与IgG H链融合基因的表达

    将融合表达质粒p^ET_28b-FH转入表达宿主菌BL21(DE3)plysS中，用IPTG诱导表达，同时做对照宿主菌BL21(DE3)plysS和原始质粒菌株p^ET_28b[BL21(DE3)plysS]的表达。图2示表达产物的SDS-PAGE电泳。从图上可以看出p^ET_28b-FH表达质粒已表达出1分子量为64kD的蛋白质。经凝胶扫描成像系统分析，融合蛋白的表达量约占菌体总蛋白的10%。进一步鉴定，表达的融合抗体是以包涵体形式存在。

图1  表达质粒p^ET_28b-FH的构建

2.3  64kD融合蛋白的免疫原性鉴定

    图3的ELISA结果表明。阳性对照1产生了较浓的颜色，表达质粒菌株p^ET_28b-FH[BL21(DE3)plysS]的表达产物2也产生了较浓的颜色，阴性对照3颜然很淡。1和2比阴性对照3颜色差别显著。因此，ELISA结果表明由重组质粒p^ET_28b-FH表达的融合蛋白具有O型FMDV的免疫原性。

2.4  攻毒实验

2.4.1  重组疫苗p^ET_28b-FH对豚鼠的保护作用：经疫苗p^ET_28b-FH免疫2次的豚鼠，用100ID₅₀O型FMDV毒株进行攻击，表1结果说明，用疫苗p^ET_28b-FH免疫的豚鼠获得了良好的保护作用，保护率为66%。

2.4.2  重组疫苗p^ET_28b-FH对猪的保护作用：经疫苗p^ET_28b-FH免疫2次的长白猪，在第一次注射疫苗后63d用50ID₅₀O型FMDV毒株进行攻击，分别在72、96、120、144、186和240h后检测发病情况。表2结果指出，用疫苗p^ET_28b-FH免疫的长白猪与对照相比发病时间推迟6d，说明本疫苗有一定的保护效果。

图2  表达质粒菌株p^ET_28b-FH[BL21(DE3)plysS]的表达产物SDS-PAGE检测
1.Protein Marker;2.Control host BL21(DE3)plysS;3.Control p^ET_28b-FH[BL21(DE3)plysS];4.p^ET_28b-FH[BL21(DE3)plysS].

图3  p^ET_28b-FH质粒的表达产物ELISA检测
1.Positive control:inactivated FMDV O Type;2.Expression products of p^ET_28b-FH[BL21(DE3)plysS];3.Negative control:expression products of host BL21(DE3)plysS

表1  重组疫苗p^ET_28b-FH对豚鼠的保护作用

Group	Virus challenge (ID50)	Number protected	Protect rat/%
Control	100ID50	0/6	0
pET28b-FH	100ID50	4/6	66

表2  重组疫苗p^ET_28b-FH对猪的保护作用

t/h	72	96	120	144	168	240
Control number of ailing animals/total number	0/3	1/3	3/3	3/3	3/3	3/3
pET28b-FH number of ailing animals/total number	0/3	0/3	0/3	0/3	0/3	3/3

3  讨论

    IgG H链V区的CDR区，即抗原互补决定区，是特异性结合抗原的区域。其空间结构和与之对应的抗原的空间结构相匹配，其空间结构的变化也对应于众多抗原的千变万化。但是不管CDR区的氨基酸序列及空间结构如何变化，经过重链、轻链的配对及三维结构的折叠，V区的三个环，CDR区总是暴露于融合抗体立体结构的表面。因此将外源抗原取代CDR区，融合抗体经过三维折叠，外源抗原也应该暴露于融合抗体立体结构的表面^[5]。因此如果取代CDR区的抗原是一种抗原表位，融合抗体呈递给机体的仍然是以该抗原以天然的表位形式呈递给机体。这样的疫苗设计模拟了抗原以天然形式呈递给机体的免疫系统。是说如果不是精确地将IgG H链V区的CDR3缺失掉，那么融合抗体基因经过三维折叠，抗体的空间结构就会遭到大的破坏，插入的外源片段很可能会被包埋于空间结构的内部，而不会暴露于空间结构的表面。那样的疫苗就不会模拟抗原表位的天然形式。本实验通过基因工程方法将IgG H链的CDR3区缺失掉，代之以FMDV VP1免疫活性肽串连片段20AA~14AA~20AA的核苷酸片段。部分序列分析表明该片段基因准确地取代了CDR3区，达到了预期的设计效果，确保了这个融合抗体基因可以折叠成天然结构，使FMDV VP1的串连抗原决定簇得以暴露在融合抗体的表面，以近乎天然的形式呈递给机体的免疫系统。IgG H链的FC区含有APC细胞的受体，通过受体介导的吞噬作用，使融合抗体疫苗p^ET_28b-FH能特异性地被多种APC(抗原呈递细胞)所吞噬^[6]，增强了疫苗的免疫效果，提高了疫苗的利用率。免疫反应的有效诱导，特别是中和抗体的诱导需要抗原在体内维持一定的时间。而IgG在体内长达3~4周的半衰期可显著地提高融合抗体基因疫苗p^ET_28b-FH对机体免疫反应诱导的效果。另外，作为载体的蛋白是自体蛋白，机体一般不会对其产生免疫反应，不影响疫苗的重要使用，也无副作用，因而安全。通过以上分析，融合抗体疫苗p^ET_28b-FH的设计是合理的。动物实验结果也表明，该疫苗对受试动物产生了显著的保护作用。在以豚鼠为动物模型的实验中，66%的豚鼠被保护。国外报道，用含有VP1的重组腺病毒免疫的猪，经口蹄疫病毒攻毒后，免疫效果最好的组只抗毒4d^[8]。用同样的疫苗免疫牛，攻毒后，免疫效果最好的组也只抗毒6d^[9]。而我们的疫苗免疫猪，攻毒后整整10d才出现口蹄疫病毒感染。我们推测其主要的原因是VP1的抗原决定簇串联片段20AA~14AA~20AA取代IgG H链CDR₃区后，能够暴露于融合蛋白分子的表面，以近似天然的表位抗原形式呈递给机体的免疫系统，因而取得了一定的免疫效果。由于此融合蛋白的表达量较低，只有13.94%，按照常规的总蛋白注射量(3.5mg/mL)，每次免疫所使用的融合蛋白量仅有1.5mg。在进一步的动物实验中，若加大疫苗的用量，可能会取得更好的保护效果。

参考文献

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[9]  Sanz-Parra A,Va'zquez B et al. Journal of General Virology,1999,80:671~679