核转运与P53功能调控

«生命的化学»2001年21卷1期

倪  坚  陈江野
(中国科学院上海生命科学院生物化学与细胞生物学研究所分子生物学国家重点实验室，上海  200031)

关键词：P53；核转运；Hdm2
中图分类号：Q507

    细胞核是真核细胞内最重要的细胞器。真核细胞胞内部分被核膜分为核区与质区两个区域，因此，不可避免地存在核区与质区之间连续而有选择性的双向物质交换(核转运)。这一生理过程不是一个简单的机制，而是受到精密的调控，同时，核转运也调控着细胞其他生理过程，如基因表达。

    P53是一个转录调控因子，它的抑癌作用就是依靠其转录调控活性来实现的。对P53的抑癌作用及其转录调控机制的研究已经比较深入，但近年的研究发现，P53抑癌功能的发挥与其自身及相关蛋白质的核转运有很大的联系。

    在对肿瘤细胞的研究中发现有三类突变会影响P53的抑癌作用。第一类是P53的DNA结合区发生突变，使作为转录因子的P53无法与靶序列结合从而失去作用^[1]。第二类突变使一些抑制P53功能的蛋白质量增加，如Hdm2癌蛋白，它可以与P53结合使其失活^[2]，而第三类突变比较特殊，在某些癌细胞中，P53集中于胞质内，正常的P53穿梭于胞质和细胞核之间，突变P53的DNA结合区和一些重要的功能区并未发生突变^[3、4]。这就使研究者们开始注意P53的核转运与其抑癌作用的发挥之间的关系。

1.  核转运核心机制

    一般来说，核转运主要有三类蛋白质参与，包括核转运受体，即以Impβ超家族受体为主的核转运受体，分子接头蛋白和RanGTP酶系统。RanGTP酶系统是这一机制的核心。P53蛋白在核内核外的穿梭也依赖与RanGTP酶系统。

    RanGTPase系统包括核心蛋白Ran及其它调控蛋白质，主要有鸟苷酸交换因子RCC1，RanGTP酶活化因子RanGTP1，Ran结合蛋白RanBP1和RanBP2^[5]。

    Ran蛋白可以在GDP结合与GTP结合两种形态之间转变，RanGDP转变为RanGTP是通过核苷酸交换完成的，自然的交换速率很慢，RCC1可以将这一速率提高10⁵倍。由于正常细胞核中的GTP含量大大多于GDP含量，因此，细胞核中反应总是向生成RanGTP方向进行。RanGTP向RanGDP的转变通过Ran的GTP酶活性来实现，Ran的GTP酶活性在RanGTP1的促进下提高了大约10⁵倍，RanBP1也可以将其活力提高10倍^[5]。RanGAP1与RanBP1均只存在于细胞质中，从而协同作用，降低细胞质中RanGTP的含量。通过这种机制，形成核内外的RanGTP梯度，使核转运能够正常进行。

    RanGTP可以特异地与Impβ相关的核转运受体结合，从而调控转运受体对配体的结合，一个转运受体有两种构象，其中一种可以与RanGTP紧密结合。对内转受体(Importin)来说，无Ran结合的构象对配体结合有利，而与RanGTP结合后将导致配体的释放。晶体结构显示配体Impα(一种接头蛋白)的内转受体结合区β(IBB)和RanGTP分别与受体结合时受体的构象变化，发现内转受体与IBB结合时的构象必需经过很大转变才能变成与RanGTP结合的构象，IBB和RanGTP与内转受体的结合部位部分重叠^[6、7]，因此，RanGTP与内转受体的结合使配体Impα脱离。对外转受体(exprotin)来说,RanGTP与配体可以稳定同一个受体构象，即它们的结合有协同作用，同时与受体结合或解离。根据这些推测，内转受体在胞质中与配体结合，入核后由于RanGTP的结合使配体脱离，实现配体的内转，反之，外转受体在核内与配体以及RanGTP结合，转到胞质后，RanGTP脱离，使配体也脱离受体，实现外转^[8]。以上结果就说明了RanGTP是如何调控物质转入与转出的(图1)。

    当然，核转运并不是如上面介绍的那么简单，它还受到复杂的调控作用，如下文将提及的P53蛋白，它的转运过程就受到细胞其它因素的影响。这使得核转运能够对蛋白质功能产生影响，从而参与细胞生理过程的调节控制。

图1  RanGTP通过调控受体与配体的结合来控制底物的转入与转出
NPC，核孔复合物

2.  P53的核转运及其功能调控

    人们早就发现P53在核内和胞质内穿梭，但对它的穿梭机制及调控研究较少。P53的出核机制相对较简单，在正常细胞中，P53的表达量较低，而且穿梭于胞质与核质，当细胞处于应激状态时，P53就集中于核内，与靶序列结合，调控转录。Stommel等人发现，P53含有一个富含亮氨酸的核外转序列(nuclear export sequence,NES)，正是这一序列帮助P53转出细胞核，这一NES可以与外转受体Crml结合，从而在RanGTPase系统的协作下转出核外^[9]。NES的突变，尤其当关键的亮氨酸突变为丙氨酸时，将会使P53聚集在核内，进一步证明这一NES是核外转信号。P53的核内转机制比较复杂，虽然P53有三个核定位信号(nuclear location signal,NLS)，但这3个核定位序列只能参与一般的内转，并不足以使P53在应激状态下聚集于核内。Friedman和Tarunina等人发现，P53与DNA元件结合时往往以四聚体形式存在，四聚体形式的P53具有较高的调控活性。L344、L348以及L350对其四聚体化有重要作用^[10]，这几个位点的突变引起P53失去调控活性，而且L348、L350的突变不但使P53无法形成四聚体而且始终位于核内^[11],这主要是由于这几个亮氨酸位于NES内。这样，四聚体化、NES与核转运三者就联系了起来。在对P53晶体结构的研究中发现，单体与二聚体P53的NES均暴露在外，而四聚体的NES则被包在内部，这种构象抑制了Crml与NES的结合^[12]。根据这些结果，Jayne等人提出了P53的应激模型，该模型认为在应激状态下，P53在核内聚集主要是由于抑制了P53的核外转。DNA损伤等细胞生理变化引起P53 N末端被修饰，使之更有利于形成四聚体，而且使P53不易于Hdm2等促进P53降解有关的蛋白质的结合，提高了P53的活性，减慢了其降解速度，同时形成了四聚体化又遮蔽了NES，抑制其与Crm1的结合，使核外转受阻，从而在核内聚集^[9，12]。

    但是，在正常细胞中，核外转是必须的，因此必定存在适当的机制以调控其外转。这需要其他蛋白质的帮助，P53四聚体可能通过与一些蛋白因子的作用，使其易于解聚，解聚后的P53就把NES暴露出来，便于与Crml结合，从而实现核外转。前已提及，在一些肿瘤细胞中，似乎P53始终位于胞质中，无法发挥期 调控功能，从而引起细胞癌化，实际上，在这些癌细胞中，P53往往还是能够不断穿梭于胞质与核质之间，只是外转活性更高，这种超活性的核外转可以通过高表达P53 C末端320~360 aa(含有参与四聚体化的肽段)来抑制，有趣的是320~360 aa肽段并不含P53原有的三个核定位信号，说明转利用的是细胞内原有P53的NLS，即在这些细胞中P53的核定位信号依然有活性^[9]。这充分说明P53在细胞中的定位是动态调控的，这种动态定位调控着P53的活性，从而调控转录水平。

3.  P53相关蛋白的核转运与P53的功能调控

    在进一步研究中，人们发现P53的活性调控不但与自身的定位有关，还与其他与其相互作用蛋白质的核定位有关。Hdm2癌蛋白是一个胞内的P53抑制因子，它可以抑制P53的转录激活以及P53引起的生长抑制、细胞凋亡等作用^[13]，在有些癌细胞中，Hdm2过量表达；另一方面，P53可以激活Hdm2的基因转录，形成一个自我调控的反馈途径^[14]。Hdm2对P53的抑制不但通过抑制其转录调控活性，而且可以加速P53的胞内降解，过量表达Hdm2使胞内P53的量减少。这种促进降解的作用部分依赖泛肽水解蛋白途径^[2,15]。Hdm2本身是一个在胞质与核内穿梭的蛋白质，它带有自身的NES，其核外转机制与P53的核外转机制相近。

    研究发现，抑制Hdm2的核外转加强了Hdm2对P53的抑制作用^[16]。而另一方面，P53的正常降解必须在Hdm2能够正常核外转的条件下进行。这说明P53的功能发挥与Hdm2的定位有关。对Hdm2的研究揭示，Hdm2的核外转参与调控细胞 的生长。那么Hdm2的核外转是通过什么机制来影响P53的转录调控活性?一方面，已经有实验证明，P53的降解是通过泛肽-过氧化物酶体共同作用完成的，用成纤维细胞抑制过氧化物酶体的活力会使P53聚集而引起细胞凋亡^[17]。在这种机制中，蛋白质往往被泛肽标记，然后被送到过氧化物酶体中降外降解。过氧化物酶体在核内与胞质内都有，但两处的过氧化物酶体降解的底物不同，因此所起的功能也不同^[18]，这说明有的蛋白质需要通过核转运以在适当的过氧化物酶体中降解，因此推测Hdm2可以将P53从核内带到胞质中的过氧化物酶体中降解。但并没有证据表明P53的外转直接依赖于Hdm2，因此存在两种可能的机制，一种是Crm1分别与Hdm2和P53结合，然后将它们转运出核，出核后Hdm2再与P53结合，将P53送到过氧化物酶体中降解，另一种可能是P53先与Hdm2结合，然后再与Crm1结合，转运出核，直接将P53送到过氧化物酶体。另一方面，当P53表达量很低时，Hdm2外转机制失效引起P53活性受到抑制，这可能是由于在核内Hdm2与P53结合，抑制P53与其它调控蛋白的结合导致失活。总之，Hdm2的定位影响了P53的功能发挥，这种影响是多方面的。

4.  结语

    对P53及其相关蛋白核转运机制的研究表明，核转运可以作为一种重要的调控方式控制着细胞的生理过程。核转运对P53功能发挥的多层次调控证明了这一点。这一结果也为p53抑癌功能的研究提供了新的线索，具有重要的理论意义与应用价值。

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