α-半乳糖苷酶及其在临床输血等方面的应用

α-半乳糖苷酶及其在临床输血等方面的应用
高 新
（军事医学科学院输血研究所 北京 100850）

摘要

    α-半乳糖苷酶(α-galactosidase, α-Gal, EC3.2.1.22)是广泛存在于自然界中的一种外切糖苷酶，传统上划分为两类异构酶：α-半乳糖苷酶A和α-半乳糖苷酶B。在体内，α-半乳糖苷酶A水解以α-半乳糖残基为末端的糖复合物；而α-半乳糖苷酶B则水解以α-N-乙酰-氨基半乳糖残基为末端的聚糖及糖蛋白、糖脂等复合物，因而它实际上是一种α-N-乙酰-半乳糖胺酶。近年来，对于这两种异构酶的研究不断深入，并应用于人血型改造、异种器官移植及溶酶体贮积病的病理研究等方面。已展示出α-半乳糖苷酶在临床应用上的诱人前景。
关键词 α-半乳糖苷酶，血型转换，异种器官移植，溶酶体贮积病，输血

    α-半乳糖苷酶(α-galactosidase, α-Gal ，EC3.2.1.22)属于外切糖苷酶类，是广泛存在于人、动物、植物、真菌乃至原核生物体内的一类水解酶，它对O-糖苷键有高度专一性，可作用于多种天然及人工合成的底物，如蜜二糖，棉子糖，水苏糖，人B型血抗原和对硝基苯-β-D-半乳吡喃糖苷(p-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside, PNPG)等，反应结果是将底物上的α-D-Gal残基末端水解成半乳寡聚糖或半乳甘露聚糖。由于α-Gal在机体代谢等生理活动中具有重要作用，所以一个世纪以来，它一直是生命科学研究领域的热点。本文就α-Gal的性质及其近年来在临床上的应用进行综述。

α-半乳糖苷酶概述
    α-Gal属于糖蛋白。在α-Gal的早期研究中，通过化学提纯方法获得的酶由于数量和纯度上的限制，无法对其活性进行详尽的分析；因此人们认为α-Gal至少存在两种形式的异构酶，并分别称其为α-GalA和α-GalB。到了70年代初，随着分离技术的发展及生化技术的引进，人们开始可以得到足够纯的酶。1972年，Beutler 和Kuhl[1]首次对α-Gal进行了详细的动力学和热力学研究。他们发现：虽然两类酶都有水解α-半乳糖残基的功能，性质上却有很大差别：如α-GalA具有热力学不稳定性，Km值较低，在pH7.0时电泳迁移率最高; α-GalB具有热力学稳定性，Km值较高等。他们认为，α-GalA与α-GalB虽然分子量相近，但却受不同的基因控制而且不能互相转换，α-GalB更可能是α-N-乙酰半乳糖胺酶（α-N-acetylgalactosaminidase, α-GalNAC）。一系列的研究结果还表明，在水解糖复合物α-半乳糖残基的反应中，α-GalA的作用占80-90%，剩下10-20%才是α-GalB的作用。后来，人们已普遍认为，α-GalA才是真正的半乳糖苷酶，尽管α-GalB也有很低的半乳糖苷酶活性，但它实际应划归半乳糖胺酶类(E.C.3.2.1.49)，称为α-N-乙酰-半乳糖胺酶更为准确，但由于长期的习惯，α-GalA、α-GalB的称谓沿袭至今。

    随着分子生物学的出现和迅速发展，对α-GalA与α-GalB基因结构的研究也逐渐深入。在原核生物及真菌中，α-Gal是由mel基因家族编码的。对该基因家族的研究比较透彻，α-Gal基因结构一直是早期研究基因表达与调控的经典模型之一。人类的α-GalA基因定位于X染色体上q21-q22位[2]；α-GalB则定位于染色体22q13----qter位[3]。1985-1989年的五年时间里，Bishop等先后克隆出编码酿酒酵母、大肠杆菌和人的α-GalA基因序列。1990年，Wang等[4]克隆并测定了人α-GalB 全长cDNA序列。1998年，他们又获得了小鼠α-GalB基因[5]。迄今为止，人们已经从动物、植物、真菌及各种细菌中分离到近30个α-GalA 的cDNA序列[6]。对不同来源的α-Gal基因的比较表明，人、高等植物和真菌的α-Gal基因同源性较高，而与大肠杆菌mel基因相差较远；但α-GalA基因具有高度保守性是无可置疑的。同时，氨基酸序列近50%的相似性提示人们，这两个位于不同染色体上的异构酶基因之间必然存在着一定的联系。除cDNA 序列55.8%的同源性外，Wang等[5]还研究了编码α-GalA与α-GalB全基因中的内含子和外显子结构，发现所有α-GalA的6个内含子均可在α-GalB的外显子之间找到同源片段；而α-GalB的2-7外显子则与α-GalA的1-6外显子高度同源；但外显子A8与B8, B9则仅有15.8%的同源性[4]。这些结果表明，α-GalA与α-GalB在进化上是高度保守的，二者是由共同的祖先分化和复制而来的。关于两个异构酶基因组结构的研究仍在继续，α-Gal在临床上的应用也被日渐开发出来。

α-半乳糖苷酶与血型改造
    众所周知，输血时由于血型不符会引起急性溶血从而导致死亡，所以，把其它血型改造成通用的“万能”血—O型血，不仅可以简化输血程序，减少血源的浪费，而且在战争、自然灾害、突发事件输血救治上具有重大意义。早在六、七十年代，人们就发现α-Gal具有水解血型抗原物质的活性，并认识到利用该酶的这一特性可实现人类血型的体外改造。人类A、B、O血型是由红细胞表面作为抗原的糖链所决定的，这些结构相应地称为A、B、H抗原。A、B抗原与H抗原相比，内部核心是完全相同的，差别仅在于，前两者的末端分别比后者多出一个α-N-乙酰半乳糖残基和一个α-半乳糖残基。这样，在α-GalB和α-GalA的作用下，将末端糖残基降解后，我们就可以把A、B抗原改造成H抗原，从而也就完成了血型由A、B到O的转变[7]。早期研究中，一方面由于通过提纯制备的α-Gal无法去除唾液酸酶等杂酶而导致红细胞表面结构的破坏；另一方面由于进行酶解反应需要的酶量极大，依赖生化提纯方法难以获得足量的酶。因而，酶纯度和酶量就成了血型转变的关隘。1995年，Zhu等[8]从桑托斯咖啡豆中克隆出α-GalA的cDNA序列并获得了在酵母中的高效表达，证明重组酶具有天然酶的活性，可以将B红细胞抗原的末端α-半乳糖残基切除，使B型血转变为O型血，同时不损害红细胞的结构与功能，从而解决了B→O工具酶的来源问题。目前在美国B→O血型转变I期临床实验已经完成，II期也正在进行，预计不久将有正式的B→O血型转变产品上市。

    A到O血型改造要困难得多。原因之一是存在着两类A抗原：A1（占80%）和A2(占20%)，其中A1抗原末端比A2又多了一个α-N-乙酰半乳糖残基，这一残基不易被水解下来。另外，具有降解A抗原活性的α-GalB在自然界中的分布远不象α-GalA那样多。1995年，Hoskins[9]从肠道共栖的扭链瘤胃球菌中提取纯化了α-GalB，据称对A抗原的两个α-N-乙酰半乳糖残基具有相同的切除能力。1993-1996年，Zhu等[10]成功地从鸡肝脏中获得了α-GalB的cDNA序列并实现了在酵母中的表达[7]。只要找到合适来源的工具酶，实现A→O血型改造也就为期不远了。

α-半乳糖苷酶与异种器官移植
    异种器官移植是指用手术或其他方法将某一种属个体的器官移植到另一种属个体的对应部位。1905年，法国Princeteau进行了世界上第一例临床异种肾移植，受者术后即时效果极好，但16天后死于肺部感染。此后的近一百年里，异种器官移植历经了尝试高潮期、冷落低潮期、研究再兴高潮期。进入90年代，人器官来源不足，生物医学的崭新进展再次恢复了人们对异种器官移植的热情和信心。带有血管的异种器官移植最主要的障碍是超急性排斥反应(hyperacute rejection，HAR)，HAR的机制是由于宿主（病人）血液中存在着大量的针对移植物的天然抗体（xenoreactive natural antibodies，XNA）,即IgG和IgM。它们进入移植物血管后就会立即与血管内皮细胞上的Galα1-3 Gal结合形成抗原-抗体复合体，接着激活补体引起连锁反应使血管内皮细胞遭到破坏，最后导致血栓形成使移植物迅速梗塞坏死。如果利用α-Gal将Galα1-3 Gal表位清除，也即使天然抗体失去识别表位，就有望避免HAR。由于α-Gal具有特异性降解Galα1-3 Gal的功能，利用α-Gal来清除Galα1-3Gal表位就成为抑制超急性排斥反应的有效手段。例如，Stone等[11]直接将猪的软骨用100U/ml的α-Gal溶液于26℃浸泡4小时后，检测处理后样品与抗Gal单克隆抗体反应，结果证明Galα1-3Gal表位滴度明显降低；Osman等人[12]将α-Gal基因导入COS细胞中进行表达，从而大大减少了细胞表面的Galα1-3Gal抗原表位。其它研究小组也正致力于建立一些转基因动物模型，猪被认为是人类异种器官移植的理想供体，不过要获得可用作器官供体的动物如转基因猪等，还有很多困难需要克服。

α-半乳糖苷酶与溶酶体贮积病。
    Fabry's disease又称血管角质瘤，或法布莱综合征，于1896年分别被英国和德国人发现，这是一种罕见的家族性磷脂贮积病，影响身体主要是血管的许多系统，患病青年男性常由于闭和性的心、肾、脑等障碍而导致夭亡。一个多世纪的病理、生理、生物化学研究表明，Fabry's disease与α-GalA密切相关[13]。病人体内缺乏活性α-GalA，引起糖鞘脂在血管内皮细胞的系统性堆积，引起血管循环障碍并进而导致心、肾功能衰竭及神经系统紊乱。因此临床上把α-GalA作为一个重要诊断指标，如何纠正体内活性α-GalA的缺乏亦成为治疗Fabry's disease的主要手段。借助分子生物学技术，人们得以更确切地了解Fabry's disease的致病机理，因为α-GalA基因位于X染色体q21-q22位，所以这是一种X染色体伴性遗传病；由于α-GalA基因突变，表达无活性的酶，所以体内活性α-GalA缺乏。如今，研究的热点也从早期用正常酶代替体内缺陷酶、骨髓移植等方法，发展到利用转基因或基因敲入(knock in)技术纠正α-GalA的基因突变的治疗方法。据报道，在日本Ishii 等研究的两个转基因小鼠系(TgN2和TgN51)中，人α-GalA活性提高了3000倍[14]；而另一小组的Kase等的报道为22-11080倍[15]。通过转基因人们还获得了Fabry's disease的小鼠模型。

    当有关溶酶体贮积病的研究热点集中在α-GalA上时，Schindler等人[16]则发现了由于缺乏α-GalB活性而导致的另一种遗传性溶酶体贮积病，这种病被命名为Schindler disease。病人血管内α-N-乙酰半乳糖末端残基的糖复合物水平明显高于正常人。由于Schindler disease也是因α-GalB的基因突变导致产生无活性酶而致病，所以，在治疗上与Fabry's disease一样，可通过转基因方法来校正缺陷酶。利用转基因及其它一些前沿技术，将有可能彻底消除这两种长期困扰人类的溶酶体贮积病。

    综上所述，α-Gal在基础理论研究上，尤其是在临床应用上，由于基因工程新技术的引入而进展很快，笔者预言，α-Gal的未来将更为可观。

α-Galactosidase and its clinical application
Gao Xin 
(Beijing Institute of Blood Transfusion Medcine Beijing 100850)
Abstract
Alpha-galactosidase (α-Gal) belongs to exoglycosidases, which distributed widely in the nature. α-Gal can be classified into two groups: α-GalA and α-GalB. In vivo, α-GalA is responsible for the cleavage of terminal α-galactosidic linkages in glycoconjungates, α-GalB is an alpha-N-acetylgalactosaminidase in fact because it can hydrolyze N-acetamidodeoxy-β-D-galactosidic residues from the terminals of a variety of complex carbohydrates and glycoconjugates. Now progress is being made of these two isoenzymes, including blood group conversion, xenotransplantation and pathophysiology study of lysosome storage diseases,. There will be significant improvements in the future clinical application of α-Gal. 
Key words alpha-galactosidase; blood group conversion; xenotransplantation; lysosome storage disease; blood transfusion

参考文献

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