选择合适的萤光素酶照亮您的路程[选购宝典]

【字体：大中小】 时间：2004年09月21日 来源：Promega

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文/Keith Wood，译/戴钢（原文载于Promega Cell Notes 8）,

    现有的多种萤光素酶检测方法和多种萤光素酶基因使得您能根据实验目的选择最好的组合。我们在这里讨论一些Promega公司提供的萤光报告基因技术的特点，并叙述如何利用这些技术来满足您的需要。

简介

    在细胞生理学研究中，报告基因成为广泛应用于测量实验条件影响效果的方便工具，应用范围很广，包括分析基因转录和调控、受体功能和细胞内信号转导途径、蛋白质折叠和代谢、病原体与宿主细胞的相互作用、基因功能的RNAi抑制等。报告基因的概念基础很简单：将易于观察的参数与基因表达联系起来。然而，由于技术不断发展，在特定情况下如何选择最合适的报告基因和最合适的检测方法并不是显而易见的。

    这篇综述的目的是勾勒出Promega公司提供的萤光素酶报告基因技术的全貌。一般来说，当实验需要高度灵敏、准确定量，或进行多个样品快速分析时，优先考虑萤光报告基因。如下所述，双萤光素酶检测特别适合于从培养细胞中高效获取信息。

    这篇综述旨在帮助并指导读者选择一套能满足预期实验要求的最佳的报告基因方法。然而，这样简短的评述不可能穷尽与特定情况有关的所有信息，我们建议读者从更多的Promega文献和技术支持那里寻找更多所需要的信息。表1列出了不同的萤光素酶基因和检测试剂，作为您阅读的参考。

当实验需要高度灵敏、准确定量，或多个样品的快速分析时，优先考虑萤光报告基因

在单萤光和双萤光之间选择

    以单萤光报告基因为基础的检测是了解细胞中基因表达的方法中最快最省钱的方法。然而，由于细胞本身的复杂性，从一个报告基因得到的数据的数量可能不足以获得可靠的结果。因此，选则报告基因方法的首要考虑因素是确定单个报告基因是否足够完成任务，如果需要更多的信息量，建议用双报告基因。幸运的是，双报告基因检测的操作效率已经大大提高，几乎不比单报告基因费事。

    一般的，由双报告基因提供的更多的信息能通过两个途径改善实验结果：1）减小随机变化，这些随机变化可能掩盖有意义的关联；2）使干扰现象正态化，这些干扰现象可能存在于生物系统的内部。

减小随机可变性（variability）。由于细胞操作过程很难复制，显著的可变性可以发生在一个实验内的不同样品间，也可以发生在不同时间进行的实验之间。这些情况最明显地表现在当试图在样品之间维持均一的细胞密度和活力，以及以完全相同的条件转染外源DNA的时候。在操作多孔板时，由于横跨整个平板的热容和湿度不同带来的“边际效应”也可带来可变性。双萤光检测可以对多数这样的可变性进行对照，在样品之间得到更精确更有意义的比较(1-4)。

使干扰因素正态化。在将实验条件与报告基因的表达相联系时，与细胞生理联系着的其它事件经常干扰报告基因的表达，特别是细胞毒性效果，当用单报告基因时可能表现为基因负调控。双报告基因检测使两个报告基因的表达和细胞活性被分别独立监测，避免了数据被误释。双报告基因检测还能使细胞内的相关事件，例如RNAi对靶标的抑制极其在细胞生理上的后果之间的耦联（5, 图1），清楚地联系起来。

用单检测区别

    最常见的情况是用终点检测法测量遗传报告基因。在这些检测中，细胞在各种培养条件下先培养一段时间，然后被裂解，测量积累在这些细胞中的新合成的报告基因。另外，我们也提供在活细胞中进行的非裂解性的报告基因检测法。这些检测允许持续地监测活细胞中的报告基因表达。

表1.萤光素酶报告基因和检测系统小结

单报告基因检测	基因	检测
*终点法*
萤火虫	luc+	萤光素酶检测系统
	（改进的萤火虫萤光素酶基因）	（需要预先裂解细胞）

	hluc+	Steady-Glo^®萤光素酶检测系统
	（密码子经过优化）	（加试剂然后读数，t_1/2≥5小时）

	hlucP+	Bright-Glo™萤光素酶检测系统
	（密码子经过优化，细胞内稳定性较低）	（加试剂然后读数，t_1/2≥30分钟）

	hlucCP+
	（密码子经过优化，细胞内稳定性较低）

海肾	Rluc	海肾萤光素酶检测系统
	（需要预先裂解细胞）

	hRluc
	（密码子经过优化）

	hRlucP
	（密码子经过优化，细胞内稳定性较底）

	hRlucCP
	（密码子经过优化，细胞内稳定性较底）
*非裂解法*
海肾	同以上结构相同的海肾基因	EnduRen™活细胞底物
		（加到培养基中）

双报告基因检测	基因	检测
*双萤光素酶*
萤火虫和海肾	与以上基因结构相同	Dual-Luciferase®报告基因检测系统
		（需要预先裂解细胞，加入两种试剂）

		Dual-Glo™萤光素酶检测系统
		（加试剂然后读数）

*两种颜色*
叩头虫	lucRD	Chroma-Glo™萤光素酶检测系统
	（红色萤光）	（加试剂然后读数）

	lucGR99
	（绿色萤光；与lucRD基因高度同源）

	LucGR68
	（绿色萤光；与lucRD基因高度同源）

*报告基因和细胞活性*
海肾	同以上结构相同的海肾基因	EnduRen™活细胞底物结合CellTiter-Glo®萤光细胞活性检测

图1. 使用细胞内生物萤光检测受体拮抗剂。HEK293细胞中异丙基肾上腺素诱导的ß-肾上腺素受体的已知抑制物（propranolol，timolol 和pindolol）在含有拮抗剂（6 μM异丙基肾上腺素/1 μMRo-20-1724）的培养基中系列稀释。受体活性由耦联有CRE转录调节子的编码了PEST-去稳定海肾萤光素酶（RlucP）的受体基因监控。用非裂解法，通过EnduRen™活细胞底物在培养基中定量测量萤光。

终点法检测。 最常见的用于终点检测的生物萤光报告基因是萤火虫萤光素酶。这个报告基因的检测灵敏性很高，少到每个细胞只有几个分子都能被检测，线性范围却很广。这些特点使得不需要为特殊条件进行实验前优化，就能获得检测成功。有时海肾萤光素酶更适合于终点发法检测，但是可供选择的检测试剂却有限。一般地，海肾萤光素酶用于双报告基因检测和非裂解性检测中。两个报告基因都已研制出了密码子经过优化的基因版本，在哺乳动物细胞中的表达效率最佳。

    遗传报告基因应答转录速率变化的速度与报告基因在细胞内的稳定性有关。高度稳定的报告基因在细胞内积累的水平高，于是它们的浓度随着转录速度的变化而变化较慢。反过来，低稳定的酶在细胞内积累量较少，但应答速度快得多。为了为不同试验要求提供设计不同的报告基因，我们开发出了在细胞内具有不同稳定性的萤光素酶报告基因系列。能赋予基因较低稳定性的报告基因被称为Rapid Response™报告基因。虽然最高的应答速率一般与较低的灵敏度相联系，但在创建稳定细胞系时这个效果通常被减弱。

    传统的报告基因检测被设计为一次测量一个样品，测量那些被裂解液事先从细胞中释放出的报告基因。传统检测也以产生最大光强度为优化目的。然而，由于萤光反应的持续时间相对较短，所以除非在萤光发光计上使用自动进样器，否则这些试剂一般不适合于多孔板。对于萤火虫萤光素酶，传统检测指的是萤光素酶检测系统；对于海肾萤光素酶，传统检测是指海肾萤光素酶检测系统。

    若有一个能产生稳定萤光的检测试剂，多孔板检测就会变得更方便。不幸的是，因为光的反应减弱相对较快，所以必须在萤光强度和光持续时间之间进行折中。Bright-Glo™试剂是为一块多孔板检测而设计的，它使萤火虫萤光素酶既产生最大的萤光强度，又有足够的萤光持续时间完成多个孔的检测。Steady-Glo™试剂提供更长的萤光持续时间，但是强度较低。两种试剂都设计为可以直接在哺乳动物培养基中加入试剂，所以事先裂解细胞的步骤就不需要了。这就使使用者可以直接在多孔板上培养细胞然后一步操作就能测量表达。

非裂解性检测法 。虽然终点检测法可以简单可靠地定量报告基因表达，但它们必须破坏样品。在某些情况下，人们需要非裂解性检测，以便在一段时间内重复测量同一样品。EnduRen™活细胞底物允许至少在24小时内测量培养物中的细胞内海肾萤光素酶。同时，在进行多孔板检测时，当有必要控制总的检测体积，或加入检测试剂可能会引起麻烦的情况下，这种底物就很有用。由于EnduRen™底物作为培养基组分加入，所以定量检测萤光时不需要另外添加任何试剂。

区分双萤光

    双萤光检测允许使用者或者测量两个报告基因的表达，或者既测量一个报告基因，又测量细胞活性。在所有情况下，从一个样品可以顺序测量两个检测。大多数检测试剂都为多孔板而优化。

双萤光素酶。最常用的双检测的基础是将萤火虫萤光素酶和海肾萤光素酶的化学相结合。原理是这些萤光素酶使用不同的底物，于是可以由酶特异性来区分。这个方法由向每一样品中加入两种试剂，每个试剂加入后测一次萤光组成。第一个试剂激活萤火虫萤光反应；第二个淬灭萤火虫萤光素酶同时启动海肾萤光素酶反应。

    Dual-Luciferase®双萤光素酶检测试剂在检测之前必须裂解细胞，这样，如果用于多孔板检测的话，就需要使用试剂自动进样器。而Dual-Glo™试剂为多孔板而设计优化，提供的萤光持续时间较长。像其它为多孔板设计的试剂一样，Dual-Glo™检测直接作用于培养基中的哺乳动物细胞，不需要事先将细胞裂解。

图2. Pyrophorus sp. 叩头虫和不同的克隆萤光素酶表达的不同颜色萤光。图A. 一对发光器官位于叩头虫头部，发出绿色萤光，在这张照片上清晰可见。位于腹部凹口处的发光器官发黄橙色光，只在飞行时发光。图B.（从左到右）大肠杆菌表达的从叩头虫克隆的基因发绿色和橙色光；红色光来自一个突变的萤光素酶基因。

两种颜色。 在某些情况下，研究者希望加入一种试剂，就同时激活两种萤光素酶，这样可以减少液体的总体积，两种萤光素酶催化发出的光可以通过颜色来区别。我们开发了叩头虫萤光素酶，与萤火虫萤光素酶亲源接近，却能产生红色和绿色两种萤光。这些萤光素酶的结构几乎是一样的，只有几个氨基酸的差别，导致发出光的颜色不同。结构类似意味着在细胞内对照报告基因和实验报告基因对细胞内的生物化学变化应答相似，使得相对于对照的正态化更为精确。
编码这些报告基因的Chroma-luc™基因的密码子已经为哺乳动物表达优化过。我们开发了两种发出绿光的报告基因，其中一个与发红光的基因几乎相同，另一个的蛋白质与发红光的基因存在最大差异。蛋白质有最大差异的基因可用于希望避免遗传重组发生的情况。

    设计Chroma-Glo™检测试剂的目的是用于多孔板检测，配方支持两个报告基因同时反应的最佳反应动力学，而且它直接在培养基中反应。由于Chroma-Glo™检测需要区分两种颜色，所以带有颜色滤光片的萤光发光计是必须的。因为光从滤光片中穿过，所以比起其它检测来灵敏度有所降低，当相对浓度相差大约100倍时，两种萤光素酶都能通过滤光片检测到。这个差别比通过化学区分的双萤光素酶检测低，双萤光素酶的浓度可以相差1000倍。

    遗传报告基因和细胞活性。虽然以两个遗传报告基因为基础的双检测可用于间接监控细胞活性效果，但有时希望更直接的测量。CellTiter-Glo®萤光细胞活性检测是一种快速灵敏的细胞活性检测方法，基础是细胞内ATP的萤光检测。因为在CellTiter-Glo®检测配方中使用了稳定的萤火虫萤光素酶，它不能直接与一个报告基因检测结合在一起检测萤火虫萤光素酶的表达。不过，它却可以与非裂解性海肾萤光素酶检测结合在一起。

    向培养基中加入EnduRen™底物，海肾萤光素酶的表达可以被定量，或被连续监控。报告基因测量完成之后，就可以定量测量，或者连续监控海肾萤光素酶的表达。结束了报告基因测量之后，就可以向样品中加入CellTiter-Glo®检测试剂，使海肾萤光素酶失活并启动依赖于ATP的萤光。因为CellTiter-Glo®检测是终点检测，因此不能在测量细胞活性之后再进一步监控样品。

小结
    这里简短介绍了现有的生物萤光报告基因和检测试剂，阐述了这些方法能够赋予的实验策略的广度。我们权衡了选择单萤光素酶还是双萤光素酶合适、终点检测相对于非裂解性检测、报告基因细胞内的稳定性和它们对转录速率的反应性，以及是为单个样品、还是为多孔板而设计的检测试剂。在为每一个检测系统所写的操作手册和其它技术文章中，您可以找到更多的信息。这些资料及其产品和应用的更新内容，都可以在我们的网站（www.promega.com/applications/genexp_reptr）上找到。或者，有任何问题都可以问我们的技术服务科学家（techserv@promega.com）。

参考文献
1. Wood, K.V. (1998) Promega Notes 65,14-20.
2. Hawkins, E.H., Butler, B., Beck, M., O’Grady, M., Orr, L., Wood, K.V. (2002) Promega Notes 81,22-6.
3. Hannah, R., Jennens-Clough, M., Wood, K.V. (1998) Promega Notes 65, 9-14.
4. Faridi, J. et al. (2003) Clin. Can. Res. 9, 2933-39.
5. Hirose, F. et al. (2002) Mol. Cell. Biol. 22, 5182-93

操作手册
Luciferase Assay System Technical Bulletin #TB281