光、电镜通用的新型融合标签：高尔基器有丝分裂过程（图）

生物通报道：最近，来自美国国家研究中心（National Center for Microscopy and Imaging Research）的Guido M. Gaietta等研究人员研制出一种融合标签，对减数分裂过程中高尔基器的变化进行了详细观察，研究结果刊登于11月21日PNAS。

　　

生物通报道：能应用于光学显微镜和电子显微镜的联合分子标记效果显著，特别是在分析高尔基器（Golgi apparatus）等动态细胞器时具有独特优势。

高尔基器在减数分裂（mitosis）初期进行分裂，经过一系列至今还不清楚的事件以后，重新聚集。高尔基体膜（Golgi membranes）的精确定位，以及减数分裂过程中的固有蛋白仍然不甚明了，部分原因在于分子标记和光学显微镜的分辨率都很有限。

最近，来自美国国家研究中心（National Center for Microscopy and Imaging Research）的Guido M. Gaietta等研究人员研制出一种融合标签，对减数分裂过程中高尔基器的变化进行了详细观察，研究结果刊登于11月21日PNAS。

研究人员首先设计出一种由荧光蛋白标记的α-mannosidase（甘露糖苷酶） II的前117个氨基酸残基、一种荧光蛋白和半胱氨酸基序组成的融和标签。随着标签暴露于高尔基体内腔，甘露糖苷酶成分可以作为进入高尔基膜的参照物。这种荧光蛋白不需要其他辅助设备，在光学显微镜下可见，但半胱氨酸标记在穿膜过程中经过磷酸化后会明显变弱，加上ReAsH标记，在光学显微镜下操作，激发氨基联苯胺的光电转换（photoconversion），进而在活细胞内进行4D光学记录，辅助电子显微镜分析超结构。

研究发现高尔基器重新组装是细胞有丝分裂末期，四条共线性簇（colinear clusters，生物通编者译）和两个子细胞前体（two per daughter cell）形成的先决条件。每个子细胞内，中间体（midbody）附近的小的簇会逐渐在细胞核的远侧聚集为一个大的簇，并不对称地重新聚集为一个高尔基器，先在一个子细胞中形成，然后在另一个子细胞中形成。

Gaietta等的工作对高尔基在有丝分裂过程中的分离、重新组装进行了前所未有的描述，提供了在4D成像以及相关的高清晰分析中对重组蛋白分布跟踪的有效途径。（生物通记者 小粥）

构建、确认一个用于EM和LM成像的高尔基标记。

（A）利用GFP和半胱氨酸基序构建一个融合靶标，并用于相关的LM/EM。GFP和ReAsH之间的FRET（荧光共振转移）用于激发DAB的光电转换。因为FRET只发生在接触紧密的染料之间，只有双砷化合物(biarsenical)与4C结合后，才会接收GFP传递的能量，产生单纯氧，进而增加光电转换的特异性（比例尺：≈1nm）注意：半胱氨酸的结构只是一个模型，不是一张实验照片。
（B）翠绿色的GFP-4C（eGFP-4C）模块与MannII N-末端117个残基（包括胞内区、跨膜区和部分细胞器内部区域）融合。
（C和D）MannII-GFP-4C特异位于高尔基器。用抗Giantin（C，红色）或者抗GM-130 (D，红色)的抗体标记稳定表达MannII-GFP-4C（绿色）的HeLa细胞， Giantin是高尔基体膜的一种完整组分，GM-130是高尔基基质的一种蛋白（比例尺：≈1μm）。

（E）高尔基体内部的半胱氨酸标记只有在还原条件下才显现。HeLa细胞短暂表达胞质半胱氨酸标记的肌动蛋白，在没有TBP的条件下，FlAsH-EDT2标记高尔基常驻的MannII-CFP-4C。FlAsH与半胱氨酸标记的肌动蛋白中的不断降低的硫醇（thiol）结合，但不与ManII-CFP-4C中Golgi-luminal氧化的硫醇结合。接着，用FlAsH-EDT2和膜渗透还原剂TBP同时处理细胞。TBP瞬时降低了高尔基内的半胱氨酸，导致其与FlAsH结合（比例尺：20μm）

注：传统的观察细胞内蛋白质的表现情况，会使用GFP绿色荧光蛋白，将特定基因后面接上GFP基因，如此生成的蛋白质末端就会接上GFP而产生荧光，研究人员可以借此观察到特定基因所转录、翻译出的蛋白质的量，或是该蛋白质在细胞中的位置。然而GFP也是不完美的，例如GFP无法分辨新生成与旧有的蛋白质分子（因为无论新旧，生成的特定蛋白质后面都是相同的GFP）；另外电子显微镜虽然清晰度很高，却无法分辨GFP（除非另外使用抗体）。

2002年4月17日Science一篇文章提到，Mark H. Ellisman等人在特定蛋白质的基因后面接上一段基因，使转录、翻译出来的蛋白质末端含有Cys-Cys-Xaa-Xaa-Cys-Cys的胺基酸序列。在用FlAsH、ReAsH两种分别产生绿色与红色的染色剂染色。利用这两种染色剂加入的前后时间差（pulse-chase label），就可以看出哪些蛋白质是较早生成的，哪些是较晚生成的，更特别的是，ReAsH经过几个实验步骤后，还可以在电子显微镜下看到。