光、电镜通用的新型融合标签:高尔基器有丝分裂过程(图)

【字体: 时间:2006年11月27日 来源:生物通

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  生物通报道:最近,来自美国国家研究中心(National Center for Microscopy and Imaging Research)的Guido M. Gaietta等研究人员研制出一种融合标签,对减数分裂过程中高尔基器的变化进行了详细观察,研究结果刊登于11月21日PNAS。

  

生物通报道:能应用于光学显微镜和电子显微镜的联合分子标记效果显著,特别是在分析高尔基器(Golgi apparatus)等动态细胞器时具有独特优势。

高尔基器在减数分裂(mitosis)初期进行分裂,经过一系列至今还不清楚的事件以后,重新聚集。高尔基体膜(Golgi membranes)的精确定位,以及减数分裂过程中的固有蛋白仍然不甚明了,部分原因在于分子标记和光学显微镜的分辨率都很有限。

最近,来自美国国家研究中心(National Center for Microscopy and Imaging Research)的Guido M. Gaietta等研究人员研制出一种融合标签,对减数分裂过程中高尔基器的变化进行了详细观察,研究结果刊登于11月21日PNAS。

研究人员首先设计出一种由荧光蛋白标记的α-mannosidase(甘露糖苷酶) II的前117个氨基酸残基、一种荧光蛋白和半胱氨酸基序组成的融和标签。随着标签暴露于高尔基体内腔,甘露糖苷酶成分可以作为进入高尔基膜的参照物。这种荧光蛋白不需要其他辅助设备,在光学显微镜下可见,但半胱氨酸标记在穿膜过程中经过磷酸化后会明显变弱,加上ReAsH标记,在光学显微镜下操作,激发氨基联苯胺的光电转换(photoconversion),进而在活细胞内进行4D光学记录,辅助电子显微镜分析超结构。

研究发现高尔基器重新组装是细胞有丝分裂末期,四条共线性簇(colinear clusters,生物通编者译)和两个子细胞前体(two per daughter cell)形成的先决条件。每个子细胞内,中间体(midbody)附近的小的簇会逐渐在细胞核的远侧聚集为一个大的簇,并不对称地重新聚集为一个高尔基器,先在一个子细胞中形成,然后在另一个子细胞中形成。

Gaietta等的工作对高尔基在有丝分裂过程中的分离、重新组装进行了前所未有的描述,提供了在4D成像以及相关的高清晰分析中对重组蛋白分布跟踪的有效途径。(生物通记者 小粥)

构建、确认一个用于EM和LM成像的高尔基标记。


(A)利用GFP和半胱氨酸基序构建一个融合靶标,并用于相关的LM/EM。GFP和ReAsH之间的FRET(荧光共振转移)用于激发DAB的光电转换。因为FRET只发生在接触紧密的染料之间,只有双砷化合物(biarsenical)与4C结合后,才会接收GFP传递的能量,产生单纯氧,进而增加光电转换的特异性(比例尺:≈1nm)注意:半胱氨酸的结构只是一个模型,不是一张实验照片。
(B)翠绿色的GFP-4C(eGFP-4C)模块与MannII N-末端117个残基(包括胞内区、跨膜区和部分细胞器内部区域)融合。

(C和D)MannII-GFP-4C特异位于高尔基器。用抗Giantin(C,红色)或者抗GM-130 (D,红色)的抗体标记稳定表达MannII-GFP-4C(绿色)的HeLa细胞, Giantin是高尔基体膜的一种完整组分,GM-130是高尔基基质的一种蛋白(比例尺:≈1μm)。

(E)高尔基体内部的半胱氨酸标记只有在还原条件下才显现。HeLa细胞短暂表达胞质半胱氨酸标记的肌动蛋白,在没有TBP的条件下,FlAsH-EDT2标记高尔基常驻的MannII-CFP-4C。FlAsH与半胱氨酸标记的肌动蛋白中的不断降低的硫醇(thiol)结合,但不与ManII-CFP-4C中Golgi-luminal氧化的硫醇结合。接着,用FlAsH-EDT2和膜渗透还原剂TBP同时处理细胞。TBP瞬时降低了高尔基内的半胱氨酸,导致其与FlAsH结合(比例尺:20μm)


注:传统的观察细胞内蛋白质的表现情况,会使用GFP绿色荧光蛋白,将特定基因后面接上GFP基因,如此生成的蛋白质末端就会接上GFP而产生荧光,研究人员可以借此观察到特定基因所转录、翻译出的蛋白质的量,或是该蛋白质在细胞中的位置。然而GFP也是不完美的,例如GFP无法分辨新生成与旧有的蛋白质分子(因为无论新旧,生成的特定蛋白质后面都是相同的GFP);另外电子显微镜虽然清晰度很高,却无法分辨GFP(除非另外使用抗体)。

2002年4月17日Science一篇文章提到,Mark H. Ellisman等人在特定蛋白质的基因后面接上一段基因,使转录、翻译出来的蛋白质末端含有Cys-Cys-Xaa-Xaa-Cys-Cys的胺基酸序列。在用FlAsH、ReAsH两种分别产生绿色与红色的染色剂染色。利用这两种染色剂加入的前后时间差(pulse-chase label),就可以看出哪些蛋白质是较早生成的,哪些是较晚生成的,更特别的是,ReAsH经过几个实验步骤后,还可以在电子显微镜下看到。


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