乳腺癌的生物靶向诊断方法面面观[创新技巧]

肿瘤生物治疗（Biotheropy）是应用现代生物技术及其产品进行肿瘤防治的新疗法，它通过调动宿主的天然防卫机制或给予天然（或基因工程）产生的针对性靶向性很强的物质来取得抗肿瘤的效应。随着对肿瘤发生发展分子机制的深入研究和生物技术的发展，生物治疗已经成为肿瘤综合治疗中的第四种模式，越来越受到重视。

肿瘤生物治疗的一项重大进展是分子靶向治疗药物的成功应用，此类药物主要有两类，单克隆抗体和小分子化合物，单抗类分子靶向药物常用的有：Herceptin(贺赛汀)、Rituximab(美罗华)、IMC-C225 (Erbitux)和Avastin等；小分子化合物常用的有：Glivec(STI571, 格列卫)、ZD1839(Iressa)、OSI774 (Tarceva)。分子靶向治疗的实施首先需通过免疫组化(IHC)和荧光原位杂交（FISH）等技术正确的寻找分子靶标，根据其结果筛选合适的靶向药物，可采用单纯的生物治疗、生物化疗、生物放疗等方式进行治疗。在完成一定疗程时间和用药后通过PET/CT、CT、MRI、肿瘤标志物等检查方法评价疗效，治疗过程中注意减量维持，严密随访。

一、乳腺癌生物靶向治疗

HER-2是一种原癌基因,该基因编码一种跨膜糖蛋白HER-2,参与调控细胞的生长、增殖及分化,是公认的重要肿瘤分子标志之一,其过度表达是多种恶性肿瘤的的表型,由于在20%~30%的乳腺癌中具有HER-2 基因的异常扩增和蛋白的过度表达，因此现在也被广泛用于乳腺癌的预后评价及指导治疗。2005年版本的St Gallen指南指出：HER-2是有别于肿瘤大小、淋巴结及激素受体以外的重要预后因子，Slamon等也认为,除了淋巴结转移情况这一因素外,HER-2是乳腺癌预后评价中最有价值的分子标志。

Herceptin(贺赛汀)是一种针对HER-2/neu原癌基因产物的人/鼠嵌合单抗，能特异地作用于HER-2受体过度表达的乳腺癌细胞。1998年被美国FDA批准上市，无论单药还是与化疗药物合用治疗HER-2/neu过度表达的乳腺癌均取得了明显疗效。作用机制包括介导对过度表达HER-2/neu肿瘤细胞的CDC、ADCC等机制来抑制肿瘤生长；抑制HER-2/neu蛋白与RTK超家族的其它成员发生交联形成异质二聚体，减弱细胞生长信号的传递；介导HER-2/neu受体的内吞降解以减少其细胞表面密度，抑制肿瘤的进一步生长；通过诱导P27kipi和RB相关蛋白p130，大量减少S期细胞数目；下调细胞表面的HER-2/neu蛋白；减少血管内皮生长因子的产生。

NCCN治疗指南也指出了HER-2检测用于指导曲妥珠单抗（Herceptin，针对HER-2 蛋白的靶向单克隆抗体药物）治疗的重要性：HER-2阳性（淋巴结阳性或淋巴结阴性，肿瘤≧1cm）的乳腺癌病人都需要考虑含Herceptin的辅助治疗方案；Herceptin可以在AC序贯紫杉醇的辅助治疗方案中与紫杉醇联合使用或在辅助化疗完成后序贯使用。基于HER-2在乳腺癌诊断及治疗中重要的指导意义，采用最准确、合理的方法来检测乳腺癌细胞HER-2就尤为重要了。

二、乳腺癌 HER-2 的诊断

目前经FDA批准，乳腺癌细胞HER-2的检测方法仅有两种：免疫组织化学（Immunohistochemistry，IHC）法测定HER-2蛋白过表达(HERceptest/Dako)；荧光原位杂交（Fluorescence in situ Hybridization ，FISH）法定量检测HER-2基因扩增（PathVysion/Vysis），后者一直被认为是HER-2诊断的金标准。另外，一种新的检测HER-2过度表达的方法—色素原位杂交法（Chromogenic and Fluorescence in situ Hybridization，CISH）也得到了一定的认识和应用，并且显示与标准IHC法和FISH法结果有较高的一致性。

IHC是一种广泛应用的检测方法，它是通过特异性抗体检测细胞内及细胞表面的蛋白，FISH和CISH是在近几年开始被应用的检测方法，它们是一种在组织切片、细胞涂片及染色体制片上对核酸进行定性、定位和相对定量研究的一种分子生物学方法，具有灵敏、特异、直观等优点。

1.    IHC法

IHC的实验流程主要是以下几个步骤：封闭、滴加抗体、显色三大步骤。一般的病理实验室均有条件进行操作。

IHC的判定标准是

级别	0/1+	2+	3+
结果	阴性	弱阳性	阳性

    以FISH结果作为参比标准的话，针对IHC的准确性和敏感性，不同的实验室得出了相似的结论：IHC结果为3+时，FISH阳性率为91.7% ；IHC结果为2+时，FISH阳性率为23.3% ；IHC结果为1+和0时，FISH阳性率分别为7.4%和4.1% 。

以上结果显示IHC法在结果为1+和0+时，使用FISH方法有一定的阳性率，但是p<0.001，这表明FISH和IHC的一致性仍然是很好的，如果IHC结果为0或者1+，可以酌情应用FISH作检测；当IHC结果为2+时，一致性为23-25%，这时需要应用FISH法进行进一步的检测；3+的样本中准确率与FISH方法的一致性较高，可以直接作为诊断依据。

2.    FISH法

更多的科研工作者和检验人员倾向于使用FDA认证的Abbott-Vysis—PathVysion进行HER-2基因的检测。

这一技术在以下几个方面体现出了它的优势：实验流程操作简单（PathVysion试剂盒属于直接标记的探针，杂交后可以直接在荧光显微镜下观察结果）；能够检测出微量的HER-2基因扩增；在检测冰冻样本和石蜡样本时显示出了同等的精确度。

Abbott-Vysis 提供的FISH HER-2检测试剂包括两种，针对HER-2的单色探针和包含HER-2、17号染色体的双色探针（PathVysion/Vysis），后者能够明确区分HER-2 基因的单纯扩增和非整倍染色体。这对于明确诊断乳腺癌有重要的意义。

下面的图片显示的是应用FISH和IHC两种检测方法得出的结果：

 

3.    CISH法

CISH（色素原位杂交法，Chromogenic and Fluorescence in situ Hybridization）作为一种新的检测HER-2过度表达的方法逐步得到应用，它的原理是首先将癌基因探针用地高辛或生物素标记，利用过氧化物酶或碱性磷酸酶的反应使实验者在光学显微镜下检测福尔马林固定的石蜡包埋的组织、染色体中期分裂和固定的细胞。CISH的操作流程和FISH相似，先要进行杂交前预处理（蛋白酶消化等），然后进行杂交反应（滴加杂交液，变性，孵育杂交）、最后一步杂交后处理（洗涤封闭，免疫组化信号放大、显色）相对FISH法要繁琐一些。

它的主要优点是: 可以以组织切片的方式储藏；能做组织学评价；用普通光学显微镜进行结果观察。研究发现，在使用FDA认证的PathVysion检测结果作为为金标准时，CISH和FISH在IHC为3+时有较高的一致性；IHC为2+时CISH的敏感度与FISH相比有了一定的差异；IHC为1+和0+时CISH与FISH的差异更为明显。总体来说，CISH的正确率为93.8%，阳性预测值为91.7%，阴性预测值为95.8%。数据如图所示：

	IHC
	Negative (0 or 1+)	Weakly positive (2+)	Positive (3+)
FISH No amplification Amplification	115 11	4 1	1 25
CISH No amplification Amplification	124 2	5 0	1 25

在2+、1+和0+中，共有10个样本（6.4%）CISH没有检测出扩增。提示了当基因扩增为低水平，即每个细胞中的扩增数目在6-10时，CISH方法没有FISH敏感，会产生一定的假阴性结果。

对于大多数样本来说，如果CISH检测结果是很明确的阴性或者阳性时，则不需要对染色体进行检查。但是由于CISH无法检测非整倍染色体，对于因此产生的假阴性，各个实验室要根据自己实验条件设定一定的阈值，来减少非整倍染色体存在造成的误差。另外，由于CISH法仍然是利用过氧化物酶或碱性磷酸酶的反应进行结果的检测，其结果不可避免的显示为典型的酶学“阳性簇”，阳性信号无法准确计数。

IHC、FISH和CISH这三种方法各有利弊，在选择最合适的方法进行乳腺癌诊断时，应针对三种方法的不同特点进行选择。

IHC法阴性结果的诊断准确率是很高的，如果样本是0/1+，那么可以根据患者实际情况判定是否需要进行进一步的检测。如果结果为3+，那么一般认为是HER-2阳性，可以按照NCCN指南进行治疗。对于检测结果为2+的样本，则需要进行基因水平的检测。

FISH法结果准确，大多数欧美病理检测中心以此为标准，尤其是使用FDA认证的Abbott-Vysis—PathVysion试剂盒判定的检测结果。FISH法在低倍、高倍扩增及非整倍染色体检测中都显示了极高的灵敏度和准确性，同时FISH法对于判定冰冻切片样本和石蜡切片样本时有同等的准确性，开阔了样本的适用范围。对于价格问题，选择合适的检测形式，整体的诊断费用是可以作为必备的检测方法接收的。

CISH法操作与FISH有一定的相似之处，与FISH有较好的一致性：正确率为93.8%，阳性预测值为91.7%，阴性预测值为95.8%。应该注意的是CISH对于低倍扩增（6-10个扩增/cell）检测的灵敏度明显下降，对于有非整倍体染色体的样本，同样会有假阴性的检测结果。检测结果为酶学“阳性簇”，阳性信号无法准确计数。基于以上原因不建议使用CISH作为IHC结果为0/1+/2+样本HER-2阳性确诊的方法，在这种情况下我们建议使用FISH方法检测结果作为确诊依据。

三、小结

 

IHC、FISH和CISH三种方法在诊断HER-2方面各有特点。通过以上的比较，在准确、经济的进行HER-2检测，寻找最适合的Hercepin适用者方面，FISH或FISH与IHC组合应用无疑是最为方便、精确的方法。

生物治疗已成为21世纪肿瘤治疗的主要方向和潮流，更好地将生物治疗和其他治疗手段结合，提高治疗效果和改善生存质量，无疑将有助于生物治疗在肿瘤综合治疗中发挥重要作用。除了Herceptin（Roche）及对应的诊断标准PathVysion（Abbott-Vysis）/Herceptest（Dako）以外，目前市场上已经有多种靶向治疗的药物及相关诊断试剂盒，如针对胃肠间质瘤的Glivec（诺华），对应得检测试剂盒—C-KitpharmDx^TM(Dako); 针对大肠癌的ERBITUX（Merck）,对应的检测试剂盒—FDA认证的 EGFRpharmDx^TM（Dako）等等。我们相信随着研究的深入会有更多更好的靶向药物和诊断试剂问世，为广大的患者解除病痛。

（建议采用以下流程进行乳腺癌Her-2检测）

 

参考文献：

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3.       Prognostic, predictive and tHERapeutic implications of HER2 in invasive epithelial ovarian cancer.  Serrano-Olvera A, Duenas-Gonzalez A, Gallardo-Rincon D, Candelaria M, De la Garza-Salazar J  Cancer Treat Rev. 2006 Feb 14

4.       Interlaboratory Comparison of HER-2 Oncogene Amplification as Detected by Chromogenic and Fluorescence in situ Hybridization  Clinical Cancer Research Vol.10,4793-4798,July 15,2004

5.       HER2 Amplificatio Ratios by Fluorescence In Site Hybriduzation and Correlation with Immunohistochemistry in a Cohort of 6556Breast Cancer Tissure  Clinical Breast Cancer 63-69 April 2004

6.       HER-2 Testing and Trastuzumab THERapy for Metastatic Breast Cancer: A Cost-Effectiveness Analysis  Journal of Clinical Oncology Vol.22 NUMBER 5. MARCH 2004

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