地高辛(DIG)应用小帖士[心得点评]

【字体：大中小】 时间：2006年08月10日 来源：Roche

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　　介绍地高辛标记DNA、RNA的注意事项和应用。

Roche供稿

DIG应用小帖士：

DNA的标记和检测（Southern Blotting）

如果用以探针合成的DNA的模板的数量比较少或是质量不够高的时候，建议您使用PCR DIG Probe Synthesis Kit。改试剂盒是专用于制备高灵敏度的杂交探针，例如单拷贝的基因。其另一个特点就是无需之间的定量斑点检测过程，通过定量凝胶电泳就可以快速确定PCR标记探针的效率。

如果您手上又足够数量的高纯度模板，就建议您使用采用随机引物标记方法的DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kits I 和II。这两个试剂盒包含了标记，封闭，杂交和检测锁需要的所有试剂，是真正意义上的一站式服务的试剂盒，提供您DIG标记和检测实验需要的所有产品。它们之间的差别在于检测方法的不同：Starter Kits I采用了显色法，使用LE NBT/BCIP；而Starter Kits II选用化学发光法底物CSPD。

详细的DNA杂交探针标记方法，可参考罗氏应用科学部DIG Application Manual for Filter Hybridization 88页。

RNA 的标记和检测（Northern Blotting）

在Northern blotting中即可以使用DNA探针，也可以使用RNA探针。通常，RNA探针的特异性和灵敏度度都会更高一些；当然如果对灵敏度和特异性没有特别严格的要求的话，DNA探针会更方便操作。

如果您需要制备RNA探针的话，推荐您使用Northern Starter Kit。该试剂盒以线性的DNA为模板，通过SP6, T7或是T3 RNA聚合酶的作用将DIG-11-UTP掺入到转录的RNA中，借助化学发光底物CDP-Star检测。另一个产品DIG RNA Labeling Kit也可用于RNA探针的标记。

想了解详细的RNA探针的使用及完整的Northern Blot操作过程，参考可参考罗氏应用科学部DIG Application Manual for Filter Hybridization 98页。

标记探针的定量

尽管DIG系统的灵敏度很高，为了获得理想的实验结果，标记探针和模板的用量是很重要的。同样在每次标记实验后，通过spot test检测探针的标记效率也是非常重要的，可用以准确计算杂交实验中的探针用量。杂交实验中探针用量的不准带来的影响是显而易见的：探针的用量太多会带来太多的背景问题，而探针的用量过少，则又会导致杂交信号太弱。Table 1中列出了一般杂交式样中建议使用的DIG标记探针的使用量。

DIG系统的优势就在于：DIG PCR探针的产量可以通过凝胶电泳的方式来定量。RNA 探针则可以检测到探针的完整性。

关于详细的探针标记效率直接测定的方法请参阅相应的产品说明书以及可参考罗氏应用科学部DIG Application Manual for Filter Hybridization 79页。

杂交温度

杂交条件的优化取决于杂交片段的类型以及GC含量。RNA-RNA和RNA-DNA间的杂交温度就要比DNA-DNA间的高。总体来说，不同片段间的杂交作用力RNA-RNA>RNA-DNA>DNA-DNA。因此做为一个通常的规律，以40％GC含量的哺乳动物目的片段为例，在DIG Easy Hyb (DIG系统专用，无毒，绝对不含DNase、RNase和任何的污染物) 或是50％甲酰胺存在环境下的杂交温度分别是：

è DNA-DNA: 37－42℃

è DNA-RNA: 50℃

è RNA-RNA: 68℃

靶核酸的胶上样量

由于DIG系统的高灵敏度的特点，靶核酸的胶上样量要小于其他的系统（Table 2）。同时DIG系统匹配的阳离子的尼龙膜也为DIG标记的杂交检测实验提供了最强的信号和最低的背景影响。

检测方法

对于探针和靶序列间形成的杂交子的检测通常使用碱性磷酸酶耦联的抗体，采用显色或化学发光法检测（table 3）。在众多的碱性磷酸酶的底物中，我们推荐使用CDP-Star或CSPD用于化学发光检测，NBT/BCIP用于显色反应。此外对于膜杂交中的化学发光信号的检测，建议使用Lumi-Film以获得最理想的信号。

详细的操作过程，请参考罗氏应用科学部DIG Application Manual for Filter Hybridization110或119页。此外对于膜杂交中的化学发光信号的检测，建议使用Lumi-Film以获得最理想的信号。

探针的拨离和重探

详细的操作过程，请参考罗氏应用科学部DIG Application Manual for Filter Hybridization127页。

检测底物

è即用型CDP-Star

碱性磷酸酶作用于CDP-Star底物，产生的光信号被X胶片曝光或是图像设备采集。与CSPD

相比较，CDP-Star的主要特点在于由于光信号产生的速度更快（10倍于CSPD）同时强度更强，可大量缩短曝光时间。其信号的释放可以持续大概两天的时间，因此可以进行多次曝光。化学发光的底物仅仅适用于尼龙膜。

è即用型CSPD

碱性磷酸酶作用于CSPD底物，产生的光信号可被X胶片（例如：Lumi-Film）或是图像设备采集。由于其同样具有持续的发光过程，因此也可以进行多次曝光。在尼龙膜上使用CSPD或CDP-Star底物的杂交，还可进行探针的拨离和重探。

èNBT/BCIP

使用类似NBT/BCIP显色底物的好处就在于，检测的过程中不在需要X胶片，既可以使用尼龙膜也可以是使用硝化纤维素膜。然而，如果想要获得高灵敏度的检测结果，可能就需要较长的时间了（几个小时）。这种方法也有其不足之处：首先通过这种方法只能一次性获得信号，不能多次检测；在探针拨离前，需要使用二甲基甲酰胺先将膜上沉淀的颜色去除。

è其他的底物和抗体

在整个DIG系统中，还有其他的一些底物和多种荧光抗体，例如Fast Red Tablets, BM Purple, HNPP

Fluorescent Detection Set)和DAB POD Substrate ；供不同研究的需要。

实验数据

与放射性探针标记检测技术的比较：第一，放射性探针的检测时间需要18h，而DIG标记系统的检测时间仅需要15min；第二，使用DIG 标记的探针在panel B上检测到的两个克隆，在panel A 上并没有看到，而随后的实验证明了这两个克隆均为阳性克隆。