RNA纯化技术[选购宝典]

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“新技术发展赋予了RNA纯化技术更高的质量，更快的速度和更好的有效性”

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一些基础性的实验室技术，比如Northern blot分析，RNA保护性实验（RNA protection assays），原位杂交（in situ hybridization）和逆转录PCR（RT-PCR）等都需要高质量，高纯度的RNA样品。但是做过RNA纯化的人都知道，准备这些样品往往耗时耗力，这主要是因为那些“可恶”的即稳定又到处可见的RNAses很容易就把这些样品降解了。

以前这些RNA制备的工作往往都需要特定的实验室，特殊的仪器，和一些专门从事这一方面的研究人员十分小心的操作完成，但是随着生物技术的发展，许多RNA纯化产品和操作手册的出现，研究人员也逐渐可以轻松解决RNA纯化问题，专注于自己的科学研究内容了，即使是缺乏RNA操作专家的实验室也能放心着手基因表达分析的研究了。

细胞裂解

RNA提取的第一步是细胞裂解，这一步简而言之就是要使组成细胞膜的蛋白变性。

1979年John Chirgwin和他的同事发明了一种可以不改变核苷酸而破裂细胞膜的方法：先将组织在异硫氰酸胍（Guanidine Thiocyanate）——一种蛋白变性剂和b-巯基乙醇——一种还原剂中混合均匀（胍基裂解法），然后通过乙醇抽提或者氯化铯梯度超速离心就可以分离纯化细胞中的RNA了。这种技术是第一种可以特异性分离RNA的方法，但是存在许多缺点，比如这种技术耗时长，低效率，也存在一定的危险性和不一致性。

1987年Piotr Chomczynski和Nicoletta Sacchi对这一技术进行了改良，他们通过将异硫氰酸胍和酚/氯仿（phenol-chloroform）结合起来，将抽提的步骤缩短到了一步，这一修改至少带来了两个改进：第一，减少了RNA分离的时间，增加收集到的样品数，二来就是减少了RNA的损失，增大了样品选择范围，允许研究人员从更少量样品数中纯化RNA。然而尽管优化了纯化步骤，但是这种方法仍然有一些不足之处，比如说，超速离心不仅需要昂贵的设施，而且也经常导致RNA凝集，形成pellets，不利于悬浮。而且粗糙的有机溶剂也会引起样品中RNA断裂，造成损失。

在进一步完善这些方法的道路上，许多生物技术公司也贡献不小，比如著名的RNA公司Ambion（现RNA部门已被ABI收购），旗下的ToTALLY RNA™总RNA提取试剂盒就是基于Chomczynski和Sacchi的异硫氰酸胍，酚:氯仿方法，这个试剂盒包含了这一方法所需的除异丙醇以外的所有试剂。通过Ambion的试剂整合和流水线操作，ToTALLY RNA™试剂盒可以从来源广泛（包括植物组织到细菌在内的许多来源），样品量较低（10g组织或者10⁹培养细胞）的条件下纯化得到高质量RNA。

另外一个倍受关注的，改进了RNA分离提取方法的生物技术公司就是GE（原Amersham Biosciences）公司了，虽然GE采用的也是异硫氰酸胍方法，吸取了其中的优点，但是他们的RNA提取试剂盒利用氯化锂和三氟醋酸铯（cesium trifluoroacetate，CsTFA）进行选择性沉淀和密度离心，这样就不用依赖于有机溶剂，可以用普通的离心机在60分钟内，从少至25mg或者10⁶-10⁸细胞样品中分离得到RNA，而且CsTFA离心对于避免RNAses降解作用也有更高的保护作用。

近期GE又推出了一款新产品：RNAspin总RNA分离试剂盒，这一系列试剂盒采用了最新的硅胶膜离心柱，配合独有的预过滤器和柱上 DNaseI 酶解等技术， 能确保每次实验都能得到所需要的产率、纯度和重复性，这一试剂盒就像是特别为敏感的下游应用，例如定量RT-PCR 及微阵列分析而设计的一个RNA纯化分离试剂盒。

除此之外，Maxim Biotech则提供了一种能从任何组织或者细胞类型的样品中提取RNA的试剂盒：Gstract™总RNA分离试剂盒，这一试剂盒有一个独特的附加提取步骤，能减少DNA和其它污染物的含量，因此得到的RNA可以直接用于一些譬如RT-PCR的实验。还有PGC Scientifics公司的RNA NOW^®，一种60分钟内从10⁷细胞或者100mg组织中分离RNA的产品，这一试剂盒最大的特点就是生物可降解性，是一种不需苯酚的环保型试剂。另外Qbiogene Inc也推出了一种总RNA提取试剂盒：Safekit™，可以从10-100mg组织样品中得到100ug总RNA。

离心分离

几个公司已经将胍基裂解法进行改进，利用RNA吸附硅胶和玻璃质离心管代替了有机溶剂提取步骤。这些改良系统的主要优点是：使用者可以避免有害的有机溶剂，例如，酚、三氯甲烷、异丙醇。根据不同的设计方式，离心柱RNA纯化流程可以通过离心或者真空驱使细胞裂解物穿越滤膜。对于小量制备而言，生产商将滤膜安置在小型离心管中，即可简化用户的使用步骤。

QIAGEN的 RNeasy® Stabilization and Total RNA Isolation System 就是一种离心柱型RNA提取试剂盒系统。RNeasy系列试剂盒能从动物细胞、组织，植物，真菌细胞和组织中提取高质量的RNA。使用RNeasy系统，研究人员们能在不使用酚/氯仿抽提、氯化铯梯度离心、或者氯化锂或者乙醇沉淀的情况下30分钟内完成RNA样品的收集。QIAGEN公司同时也提供了为动物组织设计的RNeasy Protect Kits、为革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌设计的RNeasy Protect Bacteria Kits。这些试剂盒包含了RNAlater RNA稳定试剂，这些试剂能稳定细胞内的RNA情况，以便下游结果能准确地反映制备时样品RNA表达状态。

另一家是QIAGEN和BD 生物科学公司合资经营的品牌PreAnalytiX近几年也推出了一款RNA纯化试剂盒：PAXgene™ Blood RNA System血液RNA提取系统，临床研究人员可以利用该系统收集、储存、稳定和从全血细胞中分离RNA。抽血者将血液注入特定的PAXgene Blood RNA试管，这些试管内含有稳定RNA的试剂，能使血液样品在室温中稳定保存5天。随后，研究者可以利用PAXgene Blood RNA Kit试剂盒来分离RNA。像QIAGEN公司的RNeasy系列试剂盒一样，也是通过离心柱纯化RNA。

罗氏诊断公司应用科学部的高纯度RNA分离试剂盒(High Pure Plasmid Isolation Kit)利用玻璃纤维绒毛滤器安装在离心管内。该试剂盒利用单一的试剂裂解细胞，并失活RNAses。绒毛结合总RNA，通过DNAse 选择性的处理除去DNA污染。根据罗氏公司的介绍，该试剂盒能大范围用于全血和酵母细胞的RNA提取。能使研究人员在数分钟的情况下纯化几种样品的总RNA.

Stratagene公司也为研究人员提供Absolutely RNA RT-PCR Miniprep Kit试剂盒与Absolutely RNA Microprep kit试剂盒，前者能满足用户提取107细胞或者40mg组织RNA的要求，后者则可以用于5 x 105细胞RNA的提取，这对于激光微解剖样品尤为适用。该公司还生产了一种StrataPrep®-96 Total RNA Purification Kit试剂盒，主要用于高通量RNA纯化需要。该试剂盒允许研究人员在96孔板内提取样品RNA，能与普通的96孔板真空复合管和离心转子兼容。

大部分RNA分离试剂盒需要利用新鲜的或者低温冻存的组织作为起始提取材料。然而这些样品不是立即就能获得。为了解决这个问题，Zymo研发了Pinpoint Slide RNA Isolation System。这种系统使研究人员能轻易地在显微镜玻片上直接选择目的区域进行总RNA的提取。科学家们能通过Pinpoint Slide Isolation System I恢复经固定后的新鲜程度和冻存的目的组织总RNA。利用Pinpoint Slide Isolation System II从选择石蜡包被区域中纯化RNA。科学家们因此可以检测解剖学生稀有的组织的RNA情况和研究目的区域的RNA情况。

mRNA收集

通常，总RNA的分离只是mRNA纯化的第一步。最普遍的mRNA分离依赖于与真核生物mRNA3'端poly(A)互补的含有20-30胸腺嘧啶的oligo[dT]序列。供应商通常将oligo[dT]链通过5'的磷酸键与纤维素基质连接。使用者可以通过其来分离纯化mRNA。

Ambion公司提供了几种Poly(A)Purist™ mRNA Purification Kit试剂盒，这些试剂盒都是基于oligo[dT]-纤维素原理：Poly(A)Purist™、MicroPoly(A)Purist™小量mRNA纯化试剂盒、和Poly(A)Purist Mag mRNA纯化试剂盒。

GE（Amersham Biosciences）公司也提供了几种利用oligo[dT]-纤维素柱子的mRNA纯化试剂盒。据GE称，这些mRNA纯化试剂盒能在30-45分钟内从小量样品的总RNA中纯化出mRNA。该试剂盒包含了一种试剂，能减少核酸酶的污染风险。

BD生物科学公司和CLONTECH公司同样也提供了oligo[dT]- cellulose试剂盒。CLONTECH公司（现Takara公司）的NucleoTrap® mRNA Kit和QIAGEN公司的Oligotex® mRNA Purification System都利用了乳胶磁珠代替了纤维素与oligo[dT]共价连接。乳胶磁珠完美的球形表面能实现均一分布和最小的离心时间，产生纯化的mRNA。

尽管mRNA纯化试剂盒依赖于总RNA提取作为第一步。Amersham Biosciences 和 QIAGEN公司提供了能直接从动物组织和细胞。如：QIAGEN公司的Oligotex Direct mRNA System系统和Amersham Biosciences'公司的QuickPrep mRNA Purification 和 QuickPrep Micro mRNA Purification Kit试剂盒。

磁性分离

尽管oligo[dT]技术能够增加mRNA的纯度和产量。但是一些研究人员仍然觉得离心柱型试剂盒不便于使用。幸运的是，例如CPG, Ambion, 和 Roche等公司提供了一种基于磁性分离技术的mRNA分离试剂盒。

磁性分离技术能通过利用磁场在单一的管内实现mRNA的纯化，因此消除了液相操作过程中潜在样品的损失。磁性分离技术依赖于用聚苯乙烯和氧化铁加上多糖做成的超磁颗粒——这些颗粒仅磁场中磁化。

对于mRNA纯化来说，磁珠通过包被这些颗粒的官能团与oligo[dT]分子偶联。一旦真核生物mRNA3'端的poly(A)吸附到这些分子上，使用者通过磁场收集偶联的磁性颗粒，并从磁珠上洗脱纯化mRNA。

CPG公司提供的MPG® mRNA Purification Kit利用磁性分离技术在15分钟内从总RNA中分离纯化mRNA。该公司还提供了MPG Direct mRNA Purification kit试剂盒用于直接从动物或者植物组织和细胞中分离mRNA，而不需要总RNA分离的起始步骤。

mRNA的分离仅仅是RT-PCR, Northern blotting, 和 dot blot杂交等实验的的第一步。Roche公司提供了 MagNA Pure LC mRNA Isolation Kits I 和 II分离细胞和组织中的mRNA。这些试剂盒包含了所有必需的试剂，为MagNA Pure LC仪器设计。

GE（Amersham Biosciences）公司的Hybond Atlas RNA Purification and Labeling Kit试剂盒组合了RNA纯化、cDNA探针合成和标记试剂盒。

总而言之，RNA纯化系统的发展为生命科学家带来了真正的实惠，将他们从技术难点和有害身体的操作流程中解放了出来，现在的研究人员只需将工作的重点集中在RNA样品的后续使用上，而不是它们的制备上，这真是令人愉悦的一件事。
（生物通：张迪）