第二代高通量测序系统GS FLX引领快速基因组测序时代的到来[新品推荐]

[罗氏诊断]第二代高通量测序系统GS FLX引领快速基因组测序时代的到来

罗氏供稿

    DNA测序技术上的快速发展，加快了我们对不同物种和生物体的基因组序列和结构的研究步伐。2005年底，罗氏诊断公司和454公司推出了基于焦磷酸测序法的超高通量基因组测序系统——Genome Sequencer 20 System (GS 20)。自问世以来，已经被世界上几乎所有从事基因组测序和相关结构功能研究的顶级实验室配备使用，Nature，Science，PNAS，Cell等世界知名期刊上发表的文章就已经近五十篇。在已有GS 20的技术基础上，罗氏诊断公司和454公司不断加大创新投入，又于2007年推出了通量更大，读长更长，准确性更高的第二代基因组测序系统——Genome Sequencer FLX System (GS FLX)，相信它的出现，必将掀起测序技术的进一步革命；对整个基因组学的研究将产生巨大的推动作用。

GS FLX系统超高通量测序技术原理

GS FLX系统的测序原理和GS 20一样，也是一种依靠生物发光进行DNA序列分析的新技术；在DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，荧光素酶和双磷酸酶的协同作用下，将引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号释放偶联起来 (图 1)。通过检测荧光信号释放的有无和强度，就可以达到实时测定DNA序列的目的。此技术不需要荧光标记的引物或核酸探针，也不需要进行电泳；具有分析结果快速、准确、灵敏度高和自动化的特点。

图1：GS FLX 高通量测序方法原理示意图

GS FLX系统的操作过程
  GS  FLX系统提供了完整的从样品制备到后续的生物信息学分析解决方案。

	1）样品种类：GS FLX系统支持各种不同来源的样品序列测定：包括基因组DNA，PCR产物，BAC，cDNA，小分子RNA等等。
	2）样品DNA打断：样品例如基因组DNA或者BAC等被打断成300－800 bp的片段；对于小分子的非编码RNA，这一步骤则不需要。短的PCR产物则可以利用GS融合引物进行扩增后直接进行步骤4)的工作。
	3）衔接子连接：借助一系列标准的分子生物学技术，将A和B接头（3’和5’端具有特异性）连接到DNA片段上。接头也将在后继的纯化，扩增和测序步骤中用到。图中仅仅显示了后续步骤中要用到的单链的DNA片段。
	4）一条DNA片段＝一个磁珠：接头使成百上千条DNA片段结合到它们自己唯一的磁珠上，此磁珠被单个油水混合小滴包被后，在这个小滴里进行独立的扩增，而没有其他的竞争性或者污染性序列的影响；整个DNA片段进行平行扩增。
	5）一个磁珠＝一条读长：经过PCR扩增后，每个磁珠上的DNA片段拥有了成千上万个相同的拷贝。经过富集以后，这些片段仍然和磁珠结合在一起，随后就可以放入到PicoTiterPlate板中供后继测序使用了。
	6）数据读取和分析工具：GS FLX系统 在7.5小时的运行当中可获得40多万个读长，读取超过1亿个碱基信息。GS FLX 系统提供三种不同的生物信息学工具对测序数据进行分析，适用于不同的应用：例如多达3 GB序列的重测序，对比已知参考序列进行的扩增产物差异分析，及 120 MB的从头测序工作等。

GS FLX系统的技术优势

GS FLX系统具备的卓越性能： 一个测序反应耗时7.5个小时，获得超过1亿个的碱基数据 单个序列的读长更长，平均可达到200－300碱基左右 通量更高，每个反应可以得到超过40万个序列读长，成本大大降低 读长超过200 bp时，单一读长的准确性可以超过99.5% 测序结果一致性超过99.99% 技术成熟，提供完整的解决方案 可以进行Pair－End 测序研究

完整的软件包是GS FLX系统的又一特色： 简单易用的图形用户界面，可以用来进行作图，拼接和扩增产物差异检测等研究。 利用项目管理软件工具，可以把多次测序反应得到的数据进行成组分析，并且可以添加已完成的测序反应数据来进行其他方面的分析 利用新一代的算法得到高度可信的结果－无论是碱基识别， 拼接和作图，还是差异分析，都是如此。 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

GS FLX系统的应用
    自从2005年底GS 超高通量基因组测序系统问世以来，已经相继在世界上各大测序实验室成功落户。这项技术的第一个“试验品”就是来自有“DNA之父”之称的James D Waston，他向454公司提供了自己的血液样本。目前GS系统的用户在Nature，Science，PNAS等世界顶级的期刊杂志上已经发表了五十多篇的学术论文。（详细列表请查询https://www.roche-applied-science.com/sis/sequencing/genome/index.jsp）。与GS 20系统相比较，硬件配置和软件系统方面的革新改进，使得GS FLX系统具有了广泛的应用：

全基因组测序

• 多达120 Mb的未知基因组的测序
  －生成基因组结构概图
  －研究DNA序列的组织，分布和信息
  －基因筛查：寻找新基因，定位和功能
  －和其他基因组进行比较研究
   

• 全基因组进行从头鸟枪法测序，例如微生物基因，BAC和YAC克隆测序。
   

• 比较基因组研究
  －识别单碱基突变
  －识别突变热点和保守区域
  －识别插入或者缺失的基因
  －断定基因型和表型之间的相关关系（比如，研究药物抗性的遗传基础）
  － 基于基因测序变化进行毒性预测
  －进行流行病学分析
  －了解工业生产菌株和它们的亲代菌株序列上的差异作为进行工业生产菌株开发的遗传基础
  －进行宏基因组 （metagenomics）研究
  －古代化石DNA 测序研究
   

• 利用配对末端方法（Pair-End Tag）将Contigs拼接成Scaffolds。

转录组和基因调节研究

• 基于短Tags，ESTs, ChIP，或者GIS-PET序列的高通量转录组分析，或者miRNA 序列的基因组范围识别，小分子和非编码RNA的测序。
   

• 研究DNA的甲基化模式来进行基因调节的研究。

扩增产物分析

• PCR产物的超精细测序（应用于医学研究的重测序）
  －在混合的肿瘤样本中识别体细胞突变
  －在群体水平上发现高可信度的SNP位点
   

参考文献：

De Novo，基因组和BAC测序 GS FLX可以在一次反应中完成未知微生物和病毒基因组的全基因组测序，或者利用BAC克隆完成复杂动物和植物基因组的测序，并且可以用配对末端应用相关的试剂和软件来把contigs拼接成scaffolds	参考文献 Andries, K. et. al. A Diarylquinoline Drug Active on the ATP Synthase of Mycobacterium tuberculosis. Science. 307, 223-227 (2005) Velicer GJ et al Comprehensive mutation identification in an evolved bacterial cooperator and its cheating ancestor.  PNAS May 23, 2006 vol. 103 no. 21 8107–8112 Jarvie, T whole genome assembly using pair-end reads in E coli,B licheniformis and S cerevisiae Genome Sequencer System A pplication Note No. 1/July,2006, Available at www.genome-sequencing.com
全基因组测序进行比较基因组研究     GS FLX可以以无与伦比的方式来支持遗传变化的识别，包括异质性SNP，插入缺失，和突变热点的研究；以及流行病学，进化学和元基因组学（metagenomics）研究	参考文献 Poinar HN et al Metagenomics to paleogenomics: large-scale sequencing of mammoth DNA. Science. 2006 Jan 20;311(5759):392-4 （2006） Analysis of one million base pairs of Neanderthal DNA .Green RE et al Nature, vol. (7117), 444 330-336，2006
扩增产物重测序     利用新的扩增产物测序工具可以加速在复杂的肿瘤样本中发现体细胞突变，或者在人类，动物植物或者微生物群体中分析遗传变异性。由于GS FLX一次可以产生高通量的读长，它可以1000倍的覆盖度发现的遗传变化可以达到5％的敏感性，以5000倍的覆盖度可以达到1％的敏感性。	参考文献 Thomas RK et al Sensitive mutation detection in heterogeneous cancer specimens by massively parallel picoliter reactor sequencing Nature Medicine 2006 Jul;12(7):852-5. Sogin ML et al Microbial diversity in the deep sea and the underexplored ‘‘rare biosphere’’PNAS, 2006 vol. 103 no. 32 12115–12120
转录组研究     检测和鉴定相同表达序列标签ESTs－不管基因组是已知的还是未知的。无论是崭新的，还是已知的EST都可以进行识别，会在基因表达的水平上提供信息，不管易位和反式剪接事件是否发生。	参考文献 Gowda M et al Robust analysis of 5’-transcript ends (5’-RATE): a novel technique for transcriptome analysis and genome annotation Nucleic Acids Research Advance Access published online on September 29, 2006 Bainbridge M N et al, Analysis of the prostate cancer cell line LNCaP transcriptome using a sequencing-by-synthesis approach BMC Genomics 2006, 7:246 Nielsen K L et al., DeepSAGE—digital transcriptomics with high sensitivity, simple experimental protocol and multiplexing of samples Nucleic Acids Research, Advance Access published October 5, 2006
基因调节研究 发现新型的非编码RNA(sncRNA)。在基因组范围内识别sncRNA,更好的理解基因表达控制的机制 结合染色质免疫沉淀（ChIP）技术，完成转录因子结合位点的全基因组图谱 通过已知的亚硫酸盐处理方法，定量检测目的基因组中每个CpG双核苷酸的甲基化状态。启动子区域的低甲基化或者高甲基化都被认为是好多基因非常重要的调节机制	参考文献 Lu C et al MicroRNAs and other small RNAs enriched in the Arabidopsis RNA-dependent RNA polymerase-2 mutant Genome Research 2006:16(10):1276-88 Axtell M J et al , A Two-Hit Trigger for siRNA Biogenesis in Plants Cell 127, 565–577, 2006 Berezikov E et al Diversity of microRNAs in Human and Chimpanzee Brain Nature Genetics, Published Online 29 October 2006; doi:10.1038/ng1914 Girard A et al, A germline-specific class of small RNAs binds mammalian Piwi proteins Nature 2006 Jul 13;442(7099):199-202 Epub 2006 Jun 4. Turcott,C et al Detection and quantitation of methylation patterns using amplicon sequencing Genome Sequencer System A pplication Note No. 3/Sep,2006, Available at www.genome-sequencing.com

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超高通量基因组测序系统GS FLX最新技术解密

关于罗氏诊断应用科学部

    罗氏的诊断部门在成功收购德国宝灵曼公司（Boehringer Mannheim GmbH.）后，成立了专业服务于科学研究领域用户的罗氏诊断应用科学部（Roche Applied Science，www.roche-applied-science.com），凭借半个多世纪在生命科学研究领域积累的经验，罗氏诊断应用科学部已成为在此领域中具领先地位的试剂及系统供应商之一。从耗时少的，全自动的样本制备系统（MagNA Lyser 和MagNA Pure），到快速精准的卡盘式LightCycler®2.0/1.5和高通量模块式LightCycler®480实时荧光定量PCR系统，以及创新的超高通量基因组测序系统Genome Sequencer FLX System，罗氏诊断应用科学部研究和开发了多种应用于分子生物学相关研究领域的产品——广泛地应用在基因组学和蛋白组学研究中；同时罗氏诊断应用科学部也提供用于生物医药和诊断行业以及食品安全检测方面的试剂，为用户需求提供完整的解决方案。