如何完成膜蛋白相互作用实验？

　　

生物通报道：蛋白从来不会“单独行动”，因此在分子水平上利用这种相互作用关系能识别出新蛋白的功能，这对于蛋白质研究来说是令人欣喜的，不过这常常需要首先阻止蛋白与其它蛋白的相互作用。有两种技术是可以避开这个限制，在蛋白质组水平上获得蛋白相互作用的图谱，这就是酵母双杂交系统（yeast two-hybrid assays）和免疫共沉淀（coimmunoprecipitation） 技术。

由于酵母双杂（Y2H）技术既是在真核系统中，又能在活细胞中研究蛋白相互作用，并且功效上能对蛋白之间微弱的、瞬间的作用也能通过报告基因的表达产物敏感地检测得到，因此被认为是一种具有高灵敏度的研究蛋白之间关系的，而且适用于蛋白质组学范围的分析技术平台。近年来许多文献表明酵母双杂交技术被广泛的应用到了蛋白研究中：可以用来研究哺乳动物基因组编码的蛋白之间的互作，也可以用来研究高等植物基因组编码的蛋白之间的互作。

而coIP是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法，也是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法，主要用于抗原或者抗体的定性检测。

但是有时运用这些方法并不能完成实验，比如来自加拿大多伦多大学Donnelly细胞和生物分子研究中心的Igor Stagljar教授就遇到了这样的问题。

在Stagljar教授的“完整膜蛋白的相互作用蛋白质组学研究”（PNAS 94:5187-92. 1998）中，由于现存的生化及遗传学方法或者不能配合酵母双杂——Y2H不能用于膜蛋白，或者会破坏蛋白复合物——不适用于coIP/MS，因此不得不另想它法。

Stagljar教授采用的方法称为膜酵母双杂交（membrane yeast twohybrid，MY TH，生物通译），这种方法取了Y2H的优点：简便的遗传学操作和适合高通量分析，Stagljar认为，“这是至今为止，唯一的一种证明能用于研究全长，完整膜蛋白相互作用的筛选系统。”

MYTH利用的原理就是分离泛素系统（split-ubiquitin），将诱饵(bait)即一个完整的膜蛋白，融合到泛素的C末端（这个泛素与一个转录激活因子相连），而“猎物”或靶蛋白（prey or target protein）则融合在泛素的另一半上，bait和prey的相互作用就会让重新构成泛素，从而被一种特异性的蛋白酶剪切，释放出转录激活因子，这个转录激活因此转移到细胞核上，开启报告基因的表达。

MYTH适用于细胞质中的完整的膜蛋白研究，以及出现在任何细胞位置的膜（比如内质网，高尔基体，和线粒体）结构上的相互作用，Stagljar表示，“如果是研究酵母膜蛋白，我们的成功率是100％，因为这是在酵母的天然环境下表达膜蛋白”。哺乳动物蛋白可能比较困难，因为靶标常常需要翻译后修饰，这在酵母中不能实现。

（生物通：张迪）