一种严格的热启动高保真Taq酶--可能是目前最好的Taq酶[新品推荐]

    Taq酶的花样真不少，除了普通Taq酶之外，有热启动Taq酶，还有高保真Taq酶。

    由于Taq酶的错配率较高，不能扩增较长的片断，所以出现了高保真Taq酶，这种酶又可以分为两类，一类是Taq酶本身带有校读功能（Proofreading），可以利用自身3’>5’的外切酶活性切掉错配的碱基进行校正，从而将保真度提高十到几十倍，例如Stratagene的Pfu酶、New England Biolabs的Vent酶等，细分的话Vent酶还可以分为热稳定性特高和常规的两种。另外一类是混合酶，即在普通Taq酶中加入一定比例的有校读功能（Proofreading）的酶。当Taq酶出现错配时这种校读酶可以切掉错配碱基，从而降低错配率。根据两种酶比例的不同，保真度也不同（从3倍到10多倍），比如Clontech公司、LTI/Gibco公司的高保真Taq酶都属于这一种。

    由于Taq酶的反应效率非常高，PCR反应前在室温下将酶、引物、模版、dNTP混合时Taq酶立即开始聚合反应，在反应温度升至变性温度时已经积累了一些副产物，并在以后的反应中放大，导致杂带出现而影响结果，所以又出现了热启动Taq酶。同样热启动Taq酶又有几类，比如用WaxBeads包住酶，当反应温度升至60多度时蜡熔化，释放出Taq酶开始反应。另一类是加入Taq酶抗体，当起始反应温度升至70多度时抗体永久失活，释放出Taq酶开始反应，例如Clontech公司、LTI/Gibco公司的热启动Taq酶。还有一类是化学修饰的Taq酶，酶活性被封闭，要在94—95度加热数分钟才能回复正常活力开始反应，这是最严格的热启动Taq酶，例如QIAGEN公司的Hotstar和PE公司的金牌酶，不过可惜这类严格的热启动Taq酶不是高保真的。虽然有人说高保真不是非常必要，不过万一碰上一次出错，不说费钱了，浪费多少时间还要看个人造化。

    作为用户当然想要保真度高又是热启动Taq酶了。现在商品化的产品较为常见的是在混合酶中加入Taq酶抗体，这样既能有较高的保真度，又能避免大部分非特异扩增。但是大家一直忽略了一种情况，这种情况同样会造成非特异扩增：由于混合酶中除了Taq酶、Taq酶抗体外还有校读酶，这种酶有3’—5’的外切酶活力，可以在Taq酶被封闭时高效地将引物3’端的碱基一个一个切掉！缩短的引物会导致扩增的特异性降低从而得到一些杂带。包括Pfu在内的高保真Taq酶都存在这种问题，自身的校读功能可能部分降解引物，使引物缩短，导致非特异扩增产物的出现，甚至得不到结果。

    如今QIAGEN公司最新推出了一种严格热启动的高保真Taq酶：ProofStart DNA 聚合酶。这种酶来源于火球菌属的Pyrococcus spp.，同时具有聚合酶活力和3’—5’外切酶活力，自身具校读功能，保真度比Taq酶高10倍以上，95度的半衰期长达4小时以上。ProofStart DNA 聚合酶经过化学修饰，聚合酶活力和3’—5’外切酶活力均被封闭，只有在PCR起始加热到94度数分钟后才能解除封闭，聚合酶活力和3’—5’外切酶活力同时恢复并开始反应。这种最严格的热启动方式避免了由于引物错配或者引物降解引起的副产物，同时保证了更忠实的扩增结果。

    另外，ProofStartDNA聚合酶可以在相当粗放的条件下反应，原因在于提供的PCR Buffer中含有KCl和(NH₄)₂SO4，可以在很宽的退火温度及Mg离子浓度范围内避免引物自身退火而形成二级结构而影响PCR反应，减低了条件优化的难度。加上试剂盒提供Q-Solution，这种特殊的Buffer能够改变DNA解链的特性，专门用于一些GC含量高或者有较多二级结构、平时很难扩的片断的扩增，使得这种产品更加好用，应用范围也更广。