更快更高更强:QIAGEN Fast系列之定量PCR 4个梦想[选购宝典]

    热火朝天的实验室里，川流不息的各年级学生人人忙自己的课题，电泳、离心、PCR不时呈现“排队等位”的繁荣扩招景象。时间，精力，经费，仪器档期，试剂，空间，职位空缺...... 这年头，除了人，什么资源都紧张。想在人来人往的实验室中脱颖而出，一路高歌猛进快人一步得到实验结果？选择快速简便可靠的试剂是诀窍！

    在这个加速前进的时代，准确、经济、简便、快速，无疑是我们对每个实验产品的期待。生物通为你介绍Qiagen的4个定量PCR Kit，每个试剂盒满足你不同的期待。Qiagen的品质在全球研究人员中都享有良好的口碑，值得信赖。

简便可靠：QuantiTect Primer Assays

    也许你会说：自己设计引物原也不特别难，合成费用又很经济（虽说CPI指数叠创新高，幸而引物合成的价格却和工资一样坚定不跟风），何必购买现成引物？

    Yes，但是，最最重要的是，SYBR Green荧光染料定量PCR反应被挑刺挑最多的就是说专一性不如探针法。其实如果引物设计得好，一样能得到高特异性的结果。因此好的引物设计格外重要，从这一点看，Qiagen专家设计体系有几十万条引物设计的丰富经验，其设计的引物当然考虑更周全，经过严格的生物信息学验证，自然更有优势。此外，自力更生设计引物和合成引物是需要花费不少时间潜心Blast和Search的，不可避免地需要花费不少试剂和精力去验证合成引物是否有效，结果是否专一 ----万一实验不成功还要推倒重来，此过程消耗的定量试剂也不便宜，这个费用不过是分摊到后面而已。还有，考证定量PCR结果为啥做出不来，或者结果是否专一，也算是挺折磨精力和物力的，如何能快人一步直奔研究目标呢？

    Qiagen提供已经生物信息学验证的QuantiTect引物对，特别为SYBR Green荧光染料定量RT-PCR实验而设计，专一性强，灵敏度高，不形成二聚体，可在很宽的线性范围内精确定量，可用于验证RNAi或者芯片研究分析。由于特别针对mRNA/cDNA设计，很多情况下有助于有效区分gDNA和mRNA/cDNA，避免基因组DNA干扰，令结果更加可信。配合Qiagen下游定量试剂盒，PCR效率接近100%。即用型试剂无需费时检索和设计，更无需花费试剂和精力去验证有效性。因而能有效节约时间，精力，也节约经费（相比Taqman探针）。通常，SYBR Green荧光染料嵌入一段基因中的分子数比荧光探针要多，因而SYBR Green荧光染料法得到的CT值结果相比荧光探针能得到的要更低。

    QuantiTect Primer Assays的选择范围覆盖人类、小鼠和大鼠整个基因组范围，只要登录www.qiagen.com/GeneGlobe 即可从中选择你的目标基因。QuantiTect引物对设计上已经考虑区分基因组和cDNA，通常可以避免gDNA干扰，但是有的情况下，如单外显子基因，RNA样品中残留的gDNA还是会影响结果，这个时候就得选择内在整合了去除基因组DNA干扰的QuantiTect逆转录试剂盒，或者DNAse消化来保证逆转录反应中的RNA已经彻底去除基因组DNA的干扰。QuantiTect Primer 市场价格：人民币650元，包装是200次x50ul反应体系，如果采用25ul反应体系，则成本仅为1.6元。通常再能打折。说实话，是比自己合成贵不少，但预设计引物胜在无需设计，使用方便，且Qiagen专家有数十万条引物设计经验，引物设计考虑更加周全，令专一性更强，减少二聚体，PCR效率更高，方便你节约精力直奔研究目标。但如果你立志要在反复摸索中成为定量PCR引物设计高手，且享受来回re-search的过程，也不急着发表文章（引物设计经验要发文章可不容易哦），那么忽略这个吧。

　

准确快速：QuantiTect逆转录试剂盒（QuantiTect® Reverse Transcription Kit）

    做定量RT-PCR，准确当然是最重要的因素了。如果结果都不准，那还做啥？分步进行逆转录和定量PCR的两步法是荧光定量RT-PCR好选择。但是两步法一样可以很快很简便------QuantiTect® Reverse Transcription Kit只要20分钟就可以完成定量RT-PCR的逆转录部分，而且包括在反应前彻底去除gDNA干扰，即使低至10pg的RNA也能得到结果。

    要获得准确的定量结果，首先必须将基因组DNA彻底去除，才能保证“有且仅有”逆转录得到的cDNA被定量扩增。虽然有文章表明通过跨越外显子边界的引物设计等方法能够避免基因组DNA的扩增，可是单外显子的基因就必须彻底去除基因组DNA。Qiagen QuantiTect逆转录试剂盒里一个特殊的成分gDNA Wipeout Buffer，只要在反应前42度保温2分钟即可有效去除基因组DNA的污染而不影响后继的结果。比起用DNase处理再纯化，可节省好多成本和时间呢。

    Qiagen的OmniScript是一个“很猛很强大”的逆转录酶，高产率，高效率，即使很粗放的条件也依然能在很短的反应时间内得到好结果。而SensiScript则是一个“很细很灵敏”的逆转录酶，灵敏度很高，即使痕量的RNA也不会错过。二者联手分工合作的结果就是：即使少至10pg的RNA，多到1ug的RNA，也一样可以在20分钟内高效完成逆转录实验！这样即使激光显微切割的超微量样品，或者是低丰度表达的基因也可以对付自如。

    这双酶组合不单可以联手对付少至10pg的模板，由于这两种梅对模板的结和力非常强，在其他逆转录酶碰到复杂二级结构就会脱离模板的情况下依然能结合在模板上并打开二级结构，再配合Quantiscript RT Buffer特有成分，令高GC含量的RNA模板或者带有复杂二级结构的RNA模板都可以迎刃而解。传统的试剂盒是利用65度高温变性+冰浴来解开二级结构，再和引物退火来解决问题的。过多的操作步骤对“脆弱敏感”的RNA显然没啥好处。有了双酶和Quantiscript RT Buffer迅速高效解开纠结的RNA，为后继逆转录工作扫清障碍，不必牺牲酶的效率，不必来回温浴冰浴操作，全反应过程可以在正常的42度完成，更快得到更多产物。

    由此可见，双酶完美搭配使得对付任何一种RNA模板都可以说：No Problem！（轻快地，外加耸耸肩----汗，小时候流行的是港版“搞定”，现在都国际接轨了:）

    QuantiTect® Reverse Transcription Kit除了上述4大优点，还提供通用RT引物，这是Oligo dT和随机引物的混合，得到的cDNA产量高，不管检测目标在RNA的哪个位置，即使5'端，都可以在后继实验中得到准确结果。试剂盒成本￥2690/50次反应（20ul体积），未打折的情况下每次成本50元多一点点。来，看看图比较下，多么快速简便省心：

Figure 1 Real-time, two-step RT-PCR analysis of β-actin with (+RT) or without (–RT) reverse transcriptase. cDNA was synthesized from 100 ng total RNA, and real-time PCR was performed in duplicate on the LightCycler® 2.0 using the QuantiTect SYBR® Green PCR Kit. The β-actin-specific primers detected both mRNA and genomic DNA sequences. Control reactions with no template were also performed (green). RT step using the QuantiTect Reverse Transcription Kit. The red, flat –RT plot indicates efficient removal of residual genomic DNA. RT step using a kit from Supplier I (Enzyme SIII). The purple –RT plot indicates amplification of residual genomic DNA.

　

没有最快，只有更快：QuantiFast SYBR Green Kits

    不是我不明白，这世界变化快。“更快，更高，更强”的奥运精神用来描述当今世界的发展趋势真是贴切。研究工作也不例外。老板的期望无非是更快速度，更高产量，更强文章。连实验室里所有电脑屏保都变成到处乱晃的大字“Paper！”看到就心跳加速，透不过气来。

    如何能更快？如果有更快而可靠的新产品，当然要看看。

    定量PCR是快速检测的好方法。SYBR Green荧光染料嵌入一段基因中的分子数比荧光探针要多，信号更强，因而SYBR Green荧光染料法得到的CT值结果相比荧光探针可以更低。SYBR Green方法最大的优势是价格相对探针为低，通用性强，操作简单。

    QuantiFast SYBR Green RT-PCR Kits是一步法的RT-PCR定量试剂盒，可比常规方法提速将近60%。QuantiFast，看看名字就知道是要更快。同样是OmniScript和SensiScript的强大组合，无论低丰度基因还是超微量样品，QuantiFast SYBR Green RT-PCR Kit优化的Buffer配方使得逆转录反应步骤仅需10分钟。但是少了去除gDNA的步骤，反应温度设定为50度，以减少RNA模板的复杂二级结构。

    对于采用荧光染料的一步法定量RT-PCR来说，在逆转录反应过程中必须要完全封闭Taq聚合酶活性以避免它们提前扩增捣乱，影响定量结果的准确性。由于荧光染料可以插入反应体系中所有DNA上，如果体系中有Taq提前合成的DNA都可能对结果产生影响。因而qRT-PCR对“热启动Taq酶”的要求应该比普通RT-PCR更严格。QuantiFast里的HotStar是化学修饰的Taq酶，在反应初始完全没有活性，逆转录反应结束后只要95度5min处理后就可以脱去修饰完全恢复Taq酶活性。Qiagen旧版的HotStar是需要95度15分钟恢复活性的，原本比ABI的金牌酶更为严谨的热启动酶，最后还是要顺应研究人员“更快”的心声，现在只要5分钟就可以激活了。这也节约不少时间。

    这些还不是主要的。提速60%的真正奥秘在于缓冲Buffer中增加了新组分Q-Bond，Q-Bond里的专利组分能提高单链Primer和Taq酶之间的亲和性，使得Taq酶-Primer复合物可以一起结合到模板上，而不再需要一个一个的和模板结合----别小看这一点点进步，足以令引物模板之间的退火时间减少至几秒。再加上Q-Bond里的其他组分可帮助DNA解链和减少二级结构，使得变性和延伸步骤的时间都可以缩短，因而QuantiFast每个Cycle的完整的退火延伸时间仅需要30秒（变性时间10秒）。套用中学语文教的鲁迅名言“我哪里是天才，我是把别人喝咖啡的时间都用在工作和学习上的”，QuantiFast是“把别人退火的时间都用在退火和延伸工作上了”，QuantiFast就这么节省出一大笔时间财富了。要注意的是延伸退火的温度设定为60度，即使引物Tm值不够60度也一样。

    仅仅快是不够的，还要准才行。QuantiFast缓冲体系中还特别均衡了铵离子和钾离子的比例提高模板综合提高引物模板退火条件的严谨性，令非特异引物结合模板的比例大大减少，进一步减少非特异扩增，提高反应的专一性。同时也使得Taq酶受镁离子Mg2+影响降低到可以忽略的地步，也就不需要优化镁离子浓度啦。How come?----钾离子可以结合模板和引物上的磷酸骨架中和负电荷，提高模板引物结合力；铵根离子可以强化特异性结合的模板和引物，削弱那些非特异结合到模板上的引物之间的结合力，虽说成分还是那几个成分，这配方里的学问还真不少。

    要快，要准，还要方便。QuantiFast系列都是以MasterMix的预混合形式提供，就是说Buffer和酶与SYBR Green I荧光染料之类试剂的都预先混合好在一个管子里，只要加入模板就可以，减少加样操作次数。对于自动化高通量来说就非常有用。491和521的吸收波长和发射波长适合任何一种定量PCR仪。另外试剂盒还提供ROX荧光染料，给ABI的铁杆粉丝们校正用。

    QuantiFast SYBR Green RT-PCR Kits 400次反应，7670人民币，每次反应成本19元，通常还有折扣。如果不需要做逆转录，可以选择QuantiFast SYBR Green PCR Kits，少了RT Mix组分，80次反应是价格是￥1050/80次反应，不计折扣的情况下每次反应13元左右，以Qiagen的品质，还是相当合算。要是用探针法的研究人员，Qiagen也提供QuantiFast Probe PCR Kit，原理一样，不带SYBR Green I。（Qiagen提供材料，生物通撰写）