利用荧光素酶报告基因技术在培养细胞以及爪蟾胚胎中研究Wnt信号转导[创新技巧]

利用荧光素酶报告基因技术，研究人员可以在培养细胞以及爪蟾胚胎中利用特异性感应Wnt 信号的报告基因质粒，将目的基因对于Wnt 信号通路的微观影响通过Thermo Luminoskan Ascent 仪器显示为荧光素酶激活的信号强度，从而推测目的基因对于经典Wnt 信号通路的影响。

作者：韩家煜 清华大学生物科学与技术系细胞与发育生物学实验室 北京市，100084

Wnt 家族蛋白参与控制从线虫到哺乳动物的一系列发育过程的重要事件，对生物体的组织动态平衡也起到极为重要的作用。对于经典Wnt 信号通路（canonical Wnt pathway），当没有Wnt 蛋白时，细胞质中的β-catenin 受降解复合体调控，导致β-catenin 被泛素标记，在蛋白酶体中降解。当存在Wnt蛋白时，降解复合体活性受到抑制，β-catenin 降解减少，不再被降解，稳定后的β-catenin 将进入细胞核，与转录因子LEF/TCF 结合，激活Wnt 信号下游特异靶基因的表达。

利用荧光素酶报告基因技术，我们可以在培养细胞以及爪蟾胚胎中利用特异性感应Wnt 信号的报告基因质粒，将目的基因对于Wnt 信号通路的微观影响通过Thermo Luminoskan Ascent 仪器显示为荧光素酶激活的信号强度，从而推测目的基因对于经典Wnt 信号通路的影响。

1 材料与方法
1.1 实验用主要质粒
(1) Wnt 信号通路相关蛋白LRP5/6, Frizzled, Rspondin，Disheveled 以及目的基因x9 构建在pCS2+ 表达载体上。

(2) TOPFlash 质粒载体。TOPFlash reporter 最早是由Hans Clevers 实验室构建，除了含有一段荧光素酶报告基因，还包括TCF/LEF 结合位点，因而受β-catenin 转录活性调控。我们使用的TOPFlash 具有更高的信噪比，包含6 个TCF/LEF 结合位点（6 个重复AGATCAAAGGgggta 序列拷贝）。与对照组相比，报告基因可以被Wnt 配体激活100 倍左右，而在持续性激活的β-catenin 作用下信号能够被激活400 倍左右。

(3) Renilla 质粒载体。海肾荧光素酶(Renilla ren- iformis luciferase，简称Renilla luciferase)，更多地被用作转染效率的内参，以消除细胞数量和转染效率的差异。

1.2. 细胞培养和转染
HEK293T 细胞培养在温度为37℃，二氧化碳浓度为5% 的细胞培养箱（Sanyo）中。使用培养基为含有10% 灭活的胎牛血清的DMEM 培养基。配置1L 培养基：一袋（13.4g）DMEM 粉末培养基(Dulbecco’sModified Eagle Medium, Invitrogen)，3.7g NaHCO3, 硫酸链霉素、氨苄青霉素各0.1g, 用1M HCl 调pH 至7.2~7.6 之间。使用滤膜过滤法除去细菌。293T 细胞为贴壁生长型，细胞密度达到80~90%进行细胞传代。传代时，使用胰酶消化细胞，37℃消化1 分钟后吸取胰酶，加入DMEM 培养液轻柔吹打细胞直至细胞分散均匀，团块消失，随后根据实验需要 移取一定体积的细胞悬浮液至新鲜的完全培养液中。细胞培养36 小时后，使用高效真核转染试剂VigoFect 转染HEK293T 细胞。转染前1 小时，细胞密度达到40%~60% 为宜， 并更换新鲜的完全培养液。转染试剂的用量为：0.45ul 转染试剂/1ugDNA, 使用相同体积的生理盐水与转染试剂充分混合（Mixer），室温放置5 分钟以上，随后将要转染的DNA 样品与Mixer 充分混合，室温放置至少15分钟以后，将混合液体滴在细胞培养液中即可。如果转染时细胞密度低于30%，转染后4~6 小时更换培养液。

1.3. TOPFlash reporter assays
在96 孔板中，我们除了转染需要研究的目的基因，同时共同转染10ng/well TOPFash 质粒用于显示Wnt 信号激活强度，4ng/well Renilla 质粒作为内参。转染细胞24~48 小时后充分吸去培养基，使用Universal Lysis Buffer 裂解细胞，培养板在微型振荡器上1000rpm, 震荡25 分钟后得到细胞裂解液。然后使用威格拉斯双荧光素酶报告基因检测试剂盒（Dual-Lucy Assay Kit）中的Fassay SubstrateⅠ和Rassay SubstrateⅡ（注意避光），前者是先以荧光素(luciferin) 为底物来检测萤火虫荧光素酶(Firefly luciferase)，后以coelenterazine 为底物来检测海肾荧光素酶(Renilla reniformis luciferase，简称Renilla luciferase)，并且在后续加入Renilla luciferase 的底物时同时加入了抑制Firefly luciferase 催化luciferin 发光的物质，使后续检测仅仅测定到Renilla luciferase的活性，实现双荧光素酶报告基因检测。随后使用Thermo Luminoskan Ascent 测荧光素酶活性。仪器程序设置：volumeⅠ: 40ul; Firefly lag: 3sec; reaction: 10sec; shake 3sec; volume Ⅱ: 40ul; Renilla lag: 10sec; reaction: 10sec. 所有在细胞中的Reporter assay 都是在96 孔板中完成。每个对照组使用三个平行样品计算平均值和标准差。仪器显示的信号强度代表Wnt信号被激活的程度。(Scaling factor=1000)

1.4. 在爪蟾胚胎细胞中使用荧光素酶报告基因技术
除了在培养细胞中，我们还将荧光素酶报告基因技术扩展到爪蟾胚胎体系中进行研究，因为在爪蟾胚胎细胞中更能真实地体现Wnt 信号在生理状态下的作用。

我们收集爪蟾卵，并在体外进行人工受精。受精后，使用2% cystein 溶液处理胚胎10 分钟，随后用自来水冲洗胚胎3 次后，将胚胎置于0.1×Barth 溶液中，等待胚胎分裂到四细胞期，随后显微注射mRNA 使得目的基因过量表达并且共注射40pg/embryo TOPFlash 和8pg/embryo Renilla 质粒，显微注射后的胚胎培养在0.1×Barth 溶液中，当胚胎发育到合适时期，每1.5ml tube 收集5 个胚胎，加入30ul Universal Lysis Buffer吹打裂解细胞，4 度离心10000g，5 分钟，取出10ul 上清，使用荧光素酶活性检测仪，程序设置与HEK293T 细胞裂解体系测定相同，检测目的基因在胚胎细胞中是否能够影响Wnt信号的激活。

2 结果
2.1 在HEK293T 细胞和爪蟾胚胎中检测Wnt 信号激活强度
在HEK293T 细胞中，我们转染目的基因以及相应的TOPFlash 和Renilla 质粒，具体操作详见“材料与方法”，检测Wnt 信号。另外在爪蟾胚胎中，我们显微注射混合目的基因的mRNA以及TOPFlash 和Renilla 的质粒DNA，检测Wnt 信号（图1）。结果显示X9 能够在HEK293T细胞和爪蟾胚胎中激活wnt 信号。

   

图1 （A）在HEK293T 细胞中(96-well) 转染18ng/well 的X9 质粒。（B）在爪蟾胚胎4-cell 时期，注射Xenopus X9 mRNA（ 250pg/embryo），在st.10.5 收集胚胎裂解细胞检测Wnt reporter信号强度。

2.2 在HEK293T 细胞中共转染目的基因和经典Wnt 信号通路的不同成员
我们将目的基因分别与经典Wnt 信号通路的不同成员共转染HEK293T 细胞，从而推测出目的基因x9 可能与经典Wnt 信号通路的哪个成员产生相互作用。x9 与编码Wnt 信号通路细胞膜表面蛋白LRP5/6, Frizzled, 胞外调控因子Rspondin，以及胞内因子Disheveled 的质粒共转染，信号激活情况如果所示（图2）；结果显示X9 能够与上述成员一定程度上协同激活Wnt信号通路。

图2 在HEK293T 细胞中，5ng/well 的Frizzled，Rspondin，Dishevelled，LRP 质粒DNA 分别和3ng/well 的X9 共同转染细胞。

2.3 在爪蟾胚胎和果蝇S2 细胞中目的基因对于Wnt 信号激活的影响
我们通过以上实验，利用荧光素酶报告基因技术在培养细胞和爪蟾胚胎中过量表达目的基因（gain-of-function）可以初步研究目的基因的功能，但要进一步反映该基因的生理功能，我们还需研究在缺失该基因情况下，Wnt 信号激活是否会受到影响。因此我们使用morpholino oligonucleotides (MOs) 技术，采用缺失性实验（loss-of-function）方法，在早期胚胎中注入MOs，注射方法与显微注射mRNA 同样，从而抑制目的基因mRNA 翻译，从缺失该基因引起对Wnt 信号激活产生的影响，推测该基因的重要性。

我们在胚胎动物极半球注射x9-MO，以及相应的Wnt reporter 质粒，在囊胚期中期st.8左右收集胚胎，通过Wnt reporter assay 显示，X9-MO 较强地抑制了Wnt 对于整胚的信号激活强度（图3A）。在果蝇的S2 细胞中，我们也发现X9 在果蝇中的同源基因，对于Wnt 信号的激活也呈现类似的作用（图3B）。

   
 

图3 在爪蟾胚胎和果蝇S2 细胞中进行Wnt reporter assay。（A）在2-cell 时期，在胚胎靠动物极侧注射40pg/embryo Wnt8 mRNA 条件下，分别共注射20ng/embryo 和80ng/embryo 的X9-MO，在st.8 左右收集胚胎，裂解细胞检测Wnt信号激活情况，利用三个独立的对照组计算平均值和标准差。 (B) 在果蝇S2 细胞中，利用体外转录系统转录出在果蝇S2 细胞中X9 同源基因的dsRNA，转染S2 细胞从而下调相应基因，以armadillo dsRNA 作为阳性对照，一周之后使用用winless 质粒共转染TOPFlash 和Renilla，检测Wnt reporter 强度。

2.4 报告基因技术与其他检测手段的比较
我们发现在培养细胞和爪蟾胚胎中X9 与β-catenin 都能够协同激活Wnt 信号，因此我们进行各种实验探索信号上调的原因，在western blotting 实验中，我们发现共转x9 质粒后的β-catenin 蛋白量明显增加，那么信号的激活是否与蛋白量的增加呈现对应关系，为了回答这个问题，我们在6-well dish 中共转染160ng/well TOPFlash 和64ng/well Renilla 质粒，提取部分细胞做Wnt reporter assay，发现蛋白量的增加与信号的强弱呈现一定的对应关系（图4）。

Western blotting 相对于荧光素酶报告基因技术而言，得到结果所需时间更久，操作过程更繁琐，并且需要使用比较昂贵的抗体，在该实验中，荧光素酶报告基因激活信号强度一定程度上反映β-catenin 蛋白积累量，结果显示时间更短，操作更轻松，更经济，而且利用Thermo Luminoskan Ascent 仪器可以进行高通量实验，为设计不同的实验对照组提供很好的平台。

图4 在HEK293T 细胞中，X9 能够影响β-catenin蛋白量。1.5ug/well 的X9 质粒量DNA 与1.5ug/well 或6ug/wellβ-catenin 共转染HEK293T 细胞 (6-well)，48 小时后取出一部分细胞裂解检测Wnt reporter，一部分Western blotting 检测蛋白表达。在HEK293T 细胞中，X9共转β-catenin 激活Wnt reporter信号强度与β-catenin 蛋白量呈一定关系。

3 总结与讨论
在本实验中，我们在HEK293T 细胞，果蝇S2 细胞以及爪蟾胚胎细胞中，利用TOPFlash 质粒，显示荧光素酶活性，推测目的基因是否对于经典Wnt 信号通路激活产生影响。另外，通过共转染目的基因和经典Wnt 信号通路不同成员，我们可以初步判断目的基因在信号通路中起作用的位置。而与Western blotting 结果相比较，发现荧光素酶激活信号的强度大致与β-catenin蛋白积累量呈现对应关系，这样为以后进行类似实验提供更为经济高效的参考。

Wnt 家族蛋白参与控制从线虫到哺乳动物的一系列发育过程的重要事件，对生物体的组织动态平衡也起到极为重要的作用。经典的Wnt信号通路从胞外配体与受体相互结合开始，将信号从细胞膜传递到细胞质最后在细胞核中转录特定基因的表达是一个十分复杂的过程，利用荧光素酶报告基因技术，我们可以将微观体系内不容易探测的生理过程显示为信号激活的强度，甚至可以量化目的基因对于信号通路激活的大小，而使用Thermo Luminoskan Ascent 仪器又帮助我们高通量筛选候选基因，设计实验对照组，使得生物学实验更加快捷高效自动化，这也为其他信号通路开展相应研究提供了很好的平台。

点击索取Luminorskan Ascent化学发光读数仪的更多资料！

Luminorskan Ascent化学发光读数仪的主要应用：

报告基因分析(Reporter gene assay)
- 检测双报告基因系统（DLR 系统）

含有发光底物的免疫分析(Immunoassays)
- 使用碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶等
- 生物素/ 链亲和素连接的化学发光分析

细胞增殖与毒性(Cell proliferation & Cytotoxicity)
- MIC、EC 分析
- 生长抑制分析

细胞内Ca2+ 检测(Intracellular Ca2+)
- aequorin loading assay

ATP 分析
- 细菌biomass 分析

DNA 定量(DNA quantitation)

多药物耐药性(Multi - drug resistant)

微生物分析(Mocrobiological assays)
- 抗体灵敏度测试
- 卫生监测分析

酶活性分析(Enzymes assay)
- 通过ATP 的间接分析
- 具有化学发光底物的分析

BRET 及BRET2 测定

（本文摘自赛默飞世尔实验室产品部技术通讯 第三期）