纵观第三代测序之Helicos BioSciences[选购宝典]

测序竞赛愈发激烈。随着技术的不断改进，到底哪家公司能够首先冲过千元基因组的终点线呢？局势目前尚不明朗，但普遍认为第三代测序更有希望。生物通这次就向读者介绍几个第三代测序公司。第三站是Helicos BioSciences。

2003年，斯坦福大学生物工程系的教授Stephen Quake博士成功演示了第一个单分子DNA测序实验。不久以后，Helicos BioSciences公司成立，Quake博士便是创始人之一。Helicos的目标是开发一种能对单个分子进行实时DNA测序的方法。在克服了重重困难之后，他们终于成功了。2008年，第一台单分子测序仪上市，它就是Helicos公司的杰作——HeliScope。

虽然我们有时将第三代测序技术统称单分子测序，但具体到每个公司的技术原理，还是相差甚远。Helicos将其技术称为真正的单分子测序{True Single Molecule Sequencing (tSMS)™}技术。它与之前介绍过的Illumina测序技术有几分类似，都用了可逆终止的方法，但无需前期扩增，也就不会引入偏向性。

具体原理为：待测DNA被随机打断成小片段，在每个小片段（~200 bp）的末端加上poly-dA，并于玻璃芯片上随机固定多个poly-dT引物，其末端皆带有荧光标记，以利于精确定位。首先，将小片段DNA模板与检测芯片上的poly-dT引物进行杂交并精确定位，然后逐一加入荧光标记的末端终止子。这个终止子与Illumina的终止子可不一样，不是四色的，是单色的，也就是说所有终止子都标有同一种染料。在掺入了单个荧光标记的核苷酸后，洗涤，单色成像，之后切开荧光染料和抑制基团，洗涤，加帽，允许下一个核苷酸的掺入。通过掺入、检测和切除的反复循环，即可实时读取大量序列。最后以软件系统辅助，可分析出完整的核酸序列。

HeliScope测序仪的样本通量非常高，2个流动槽可同时运行，每个流动槽有25个独立通道，每个通道又可以运行最多96个带分子条形码的样本，这样每次运行的样本数可高达4800个。目前HeliScope每次运行的总产量达21-35 GB，尚不及第二代测序仪HiSeq 2000和SOLiD 4。测序的平均读长为35 bp，算是比较短的。其主要缺点是错误率高，这个问题困扰Helicos已久，但似乎仍未很好地解决。

但这并不妨碍Helicos出成果。去年8月，利用HeliScope测序仪，Quake博士本人的基因组报告发表在《Nature Biotechnology》上。他是继James Watson和Craig Venter之后第三位基因组测序的非匿名个体。经过4轮运行，他们产生了数十亿个序列读取，覆盖了90%的人参考基因组，覆盖度达28倍。序列读长为24到70个碱基，平均读长为32个碱基。这次测序花了4个星期的时间，试剂花费为48000美元。

此外，Helicos的平台还有其过人之处，它特别适合RNA-Seq或RNA直接测序的应用，因为它能直接测序RNA模板，而无需将其转化成cDNA。去年10月，Helicos的科学家就在《Nature》杂志上发表了一篇原理验证研究，说明利用其单分子测序技术来进行RNA直接测序的可行性。

不久前，Helicos的研究人员还利用这种技术发现了一类新颖的小RNA分子。它们在其5ʹ端都有相同的“尾巴”，由非基因组编码的“polyU”残体的一个序列组成。这些数据证实了一个由来已久但未经证实的假说，即哺乳动物细胞能够通过直接拷贝RNA分子来合成RNA，为RNA复制机制提供了证据。

HeliScope虽是最早上市的单分子测序仪，但受欢迎程度似乎不及PacBio的测序仪。PacBio的测序仪还未正式上市，就已经有人在排队了，但HeliScope从2008年上市至今，也才卖了一二十台。阻碍HeliScope热卖的一个重要原因是售价太高，目前价格大约为99.9万美元，相当于第二代测序仪的两倍。

生意不好做，Helicos只得裁员，今年5月就裁了一半的人，并将业务重新定位在分子诊断市场。Helicos的CEO Ron Lowy曾表示：“在过去几个月中，我们曾考虑了多个长期战略重点，并咨询了行业专家，最终，我们决定为新兴的诊断测序市场开发检测。我们的计划是开发并销售我们自己的MDx检测。”

未来的道路也许布满荆棘，但愿Helicos能义无反顾地走下去，为我们带来更多创新产品。（生物通 余亮）