染色体步移技术的改进[创新技巧]

染色体步移（genome walking）是一种克隆方法，可以获得与已知序列相邻的未知基因组区域。在过去20年研究人员开发出多种染色体步移的方法，大体可分为三类：反向PCR，连接介导的PCR和随机引物PCR。最近，韩国生物科学技术研究所（KRIBB）的一个研究小组对传统的连接介导PCR方法进行了改进，文章发表在近期的《Analytical Biochemistry》上。

KRIBB的首席科学家宋正勋（Jung-Hoon Sohn）认为染色体步移是一种很有效的基因克隆方法。“一旦你得到部分的基因组片段，你就能通过PCR不断获得侧翼片段。如果不使用PCR，从DNA文库中克隆不但单调，而且困难。”

然而基于PCR的染色体步移方法面临着多种问题：特异性和效率低，步移距离短，且方法复杂。宋博士解释道，尽管PCR一般需要两个起始位点，而连接介导的PCR染色体步移只需要单个起始位点。通过与缺乏5’端磷酸基团的框（cassette）连接，产生了第二个起始位点。这种方法的问题在于往往非特异扩增了许多DNA片段。宋博士及其同事开发的“模板锁定（template-blocking）”方法降低了这种非特异的扩增。

在这种新方法中，研究人员用双脱氧NTP（ddNTP）填补了限制性酶消化的基因组片段的3’-OH，并与正确设计的框连接。这样，侧翼伴有框的基因组DNA片段就作为靶基因扩增的模板，扩增引物分别为基因特异的引物和框引物。基因组DNA的末端被ddNTP锁定，从而大大降低了非特异性扩增，并产生了简单快速的染色体步移。宋博士称：“模板锁定的PCR显示出高特异性。它既不需要特殊设计的引物，也不需要巢式PCR。”

研究人员通过克隆毕赤酵母的一个PGK1新启动子和青霉菌的两个纤维素酶新基因，来检验了这种模板锁定PCR。这两种生物的完整基因组序列目前都还没有。

宋博士解释道：“真菌纤维素酶对于降解纤维素生物质产生糖和生物能量非常重要。我们从腐烂的木头中分离出这种真菌，用于新纤维素酶的克隆。它只是模板锁定PCR的一个例子，说明在未知基因组信息的情况下，从微生物中克隆基因也很简单。”

对于基因组测序已经完成的少数物种（如人、小鼠、线虫、水稻、拟南芥等）来说，可以轻松地从数据库中找到已知序列的侧翼序列。但是，对于大多数生物而言，在不了解它们的基因组序列以前，想要知道一个已知区域两侧的DNA序列，只能采用染色体步移技术。

尽管全基因组测序技术正在迅猛发展，获得多个物种的全基因组序列变得更加容易，但宋认为染色体步移的改善对于实验室日常工作仍很关键，因为很多种感兴趣的生物都未完成基因组测序，或只完成了部分。（生物通 余亮）

原文摘要：

Template-blocking PCR: An advanced PCR technique for genome walking

Jung-Hoon Bae & Jung-Hoon Sohn
Analytical Biochemistry Volume 398, Issue 1, 1 March 2010, Pages 112-116