克服基因分型研究中的五大挑战[心得点评]

QIAGEN公司曾开展了一项关于基因分型研究的调查。结果显示，尽管基因分型技术已取得不少进步，但研究人员仍面临五大技术挑战。这五大技术挑战分别是：1. 假阳性和假阴性；2. 过程太耗时；3. 分辨率和灵敏度；4. 有限的起始材料；5. 数据分析。下面让我们和QIAGEN专家一起来找原因想办法，共享QIAGEN在基因分型方面的新工具和技术。

在今年5月召开的2011年度欧洲人类遗传学大会（European Human Genetics Conference 2011）上，QIAGEN公司开展了一项关于基因分型研究的调查。34名受访者来自不同的研究领域，从群体遗传学到癌症研究。他们采用各种方法和技术来开展基因分型研究。调查结果显示，尽管基因分型技术已取得不少进步，但研究人员仍面临五大技术挑战。

这五大技术挑战分别是：
1. 假阳性和假阴性
2. 过程太耗时
3. 分辨率和灵敏度
4. 有限的起始材料
5. 数据分析

俗话说得好，工欲善其事，必先利其器。我们不仅要了解这些挑战的内在原因是什么，更要设法积极应对。下面让我们和QIAGEN专家一起来找原因想办法，共享QIAGEN在基因分型方面的新工具和技术。

挑战一：假阳性和假阴性

在基因分型研究中，假阳性和假阴性结果不仅会导致实验数据的误读，还会阻碍研究进程，因为您可能需要重新采样和重新检测，这不光耗时，还浪费宝贵的科研经费。为了降低假阳性和假阴性的风险，确保数据的准确阐释，QIAGEN专家从以下几个方面分享了他们的成功经验

PCR buffer有助于确保扩增特异性
在进行基因分型研究时目标序列的特异扩增很重要能避免假阳性。为此QIAGEN提供了一系列PCR基因分型试剂盒特别优化的PCR试剂盒确保了高的特异性和可靠性，能让您快速得到可重复的PCR数据。除了高度特异的聚合酶，QIAGEN的所有PCR试剂盒都包含了一种独特的双阳离子缓冲液，这种缓冲液促进了退火过程中特异的引物结合，从而确保了特异扩增。在较宽的退火温度和Mg2+浓度范围内，这种新型缓冲液提供了严格的引物-退火条件。以上优化均有助于PCR反应生成高度特异的扩增子，避免假阳性和假阴性的结果。

多重反应利于标准化
在同时扩增低丰度和高丰度模板时，我们经常碰到的扩增不均一的问题。PCR反应会优先扩增高丰度，易于扩增的目的片段，从而导致非特异产物或缺少预期产物。以高效率结合的引物利用更多的PCR反应成分，从而降低了其他PCR产物的产量。这常常导致某些DNA序列未被扩增，或缺少预期的PCR产物，最终导致假阳性或假阴性结果。为此，QIAGEN所有的多重PCR试剂盒都使用了一种特制的PCR缓冲液，它内含独特的添加剂MP因子。连同K+及其他阳离子，MP因子允许高效的引物退火和延伸，而与引物序列无关。MP因子提高了引物在DNA模板周围的局部浓度，并稳定了特异结合的引物。

 
独特的缓冲液促进了稳定高效的引物退火。A NH4+离子防止非特异引物与模板退火。B 合成的MP因子提高了引物在DNA模板周围的局部浓度。连同K+及其他阳离子，MP因子稳定了特异结合的引物，允许HotStarTaq Plus DNA聚合酶的高效延伸。

与单重反应相比，多重反应确保了实验的标准化，因为所有目标都利用相同的反应条件和模板量共同扩增，避免了移液和循环条件的差异。Type-it Mutation Detect PCR Kit 和Type-it Microsatellite PCR Kit都是基于QIAGEN的多重PCR技术，在确保高度可靠扩增的同时将假阳性和假阴性的风险降至最低。

内在的质量控制
一些类型的基因分型分析，如群体研究和法医学，需要定量等位基因。对于混合的细胞群体，或等位基因以低频率出现时，这极具挑战性。焦磷酸测序是一种同时能够获得定性和定量信息的序列分析技术，能确保遗传分析时的精确度和准确性。焦磷酸测序适合多种应用，从低频率等位基因的定量到未知变异体的检测。数据是在序列背景中展示的，作为结果的内在质量控制。更多焦磷酸测序信息请点击http://www.pyrosequencing.com/。

挑战二：过程太耗时

在基因分型研究中，分析时间也是一个重要的考虑因素。当然，准确的基因分型分析并非易事，这常常需要实验参数的广泛优化，可能增加时间和成本。此外，高通量应用也是既耗时，又费力。为此，QIAGEN开发出了创新的Type-it产品系列，可针对性的用于突变检测、SNP分型或微卫星分析。试剂盒以预混液的形式提供，结合优化的操作步骤，适合不同的检测平台，能简化分析并减少失败，让您节省时间和资源。

简化的步骤和预混液有助于节约时间
利用Type-it Fast SNP Probe PCR Kit开展SNP基因分型，可节省40%的时间。这些源于一种新型的添加剂Q-Bond。Q-Bond实现了在标准PCR仪和快速PCR仪上的快速循环。QIAGEN基因分型试剂盒中的HotStarTaq Plus DNA聚合酶，只需5分钟即可激活，进一步为您的PCR提速。而这些试剂盒都是以预先优化的预混液形式提供的，也能省下不少时间。

一些基因分型研究需要对与疾病相关的某个特定基因的多个不同突变进行分析。若是一个一个地分析，需要开展大量的PCR反应。这时，Type-it Microsatellite PCR Kit和Type-it Mutation Detect PCR Kit的多重能力能助您一臂之力，它们能同时扩增几个目标，简化分析过程。

分辨基因型的快速方法
传统的基因分型技术如变性梯度凝胶电泳（DGGE）、芯片和Sanger测序都很费时。而高分辨率熔解（HRM）技术能够快速鉴定DNA样品，用于SNP基因分型、突变扫描和病原菌分型。这样，先用HRM筛查可能含有多态性或突变的样品，即可降低进一步研究的样品量，节省时间和资源。 QIAGEN的Type-it HRM PCR Kit和Rotor-Gene Q循环仪联合使用为HRM型基因分型提供了一个优化的解决方案。至于为什么说Rotor-Gene Q是目前市面上用于HRM技术最精准的平台，感兴趣的读者可以点击http://www.gene-quantification.de/hrm.html。另外，别忘了上面提到的焦磷酸测序技术，此项技术在等位基因的精准定量和未知突变的检测方面也是一大利器。比如PyroMark Q24分析序列变异，15分钟内可分析1-24个样品。

自动化方案加速您的研究
从反应建立到下游分析，QIAGEN的自动化方案能进一步节省时间。在手动建立反应体系时，人为失误可能导致实验失败，使获得结果的时间延长。QIAgility可轻松实现快速、高精确度的PCR建立。这样不仅能大大节约时间和成本，还能将重新检测的样品数量降至最低。

读取PCR型基因分型分析的最常用方法是凝胶电泳。这种方法虽然简单，但从配胶到分析，也需要不少时间。QIAGEN自动化的检测平台QIAxcel Advanced System最快能在3分钟分析12个样品，大大加速实验进程。无需配胶、制胶，无需手工上样、人工拍照及人工分析，几分钟即可获得高分辨率的电泳结果。从此，和凝胶电泳说拜拜吧。

挑战三：分辨率和灵敏度

对于成功的基因分型研究而言，分辨率和灵敏度是必要的前提条件。一些基因分型研究需要检测非常细微的序列变异。为此，我们要考虑反应试剂、仪器和检测方法所提供的灵敏度。

基因分型试剂buffer有助于提高灵敏度
对于PCR型分析，目标的高度特异扩增是基本要求。新型的QIAGEN PCR缓冲液包含了专门研制的盐离子和添加剂组合，能确保反应中所有引物退火和延伸的效率相当。Q-Solution这种添加剂能确保高度特异的扩增，即使是不理想的模板。正如前面所提到的，MP因子提高了引物在DNA模板周围的局部浓度，并稳定了特异结合的引物。另外，Type-it Mutation Detect PCR Kit也确保了低丰度目标与高丰度目标以相同的效率扩增。

HRM技术能够确保基因分析分辨率
由于HRM技术本身所具有的高灵敏度，使其可以对可能含有多态性或突变的样品进行初筛HRM技术根据序列、长度、GC含量或链互补性来区分PCR产品，分辨率达单个碱基对。即使是过去未知或复杂的序列变异（如第4类A/T SNP），它也能轻松检测和鉴定。QIAGEN的Rotor-Gene Q定量PCR仪有着独特的旋转式设计，具有无与伦比的温度分辨率和准确性以及最佳的温度均一性，特别适合所有HRM应用。与Type-it HRM PCR Kit和Rotor-Gene ScreenClust HRM Software共同使用，Rotor-Gene Q为可靠的基因分型提供了一个完整的方案。
 

第4类A/T SNP的成功基因分型。利用Type-it HRM PCR Kit对人GYS1基因中的SNP进行分型，得到了高度重复且准确的结果，但供应商QIII预混液获得的结果存在较大差异。A 均一化的熔解曲线和差异图显示，利用Type-it HRM PCR Kit能准确区分第4类A/T SNP的所有三种基因型（野生型、杂合子和突变体）。B 利用供应商QIII的试剂盒开展同一实验，无法分辨野生型和突变体，导致不成功的基因分型。蓝色：野生型；绿色：杂合子；红色：突变体。

焦磷酸测序技术用于遗传变异的准确定量
对于以低频率存在的等位基因，或混合细胞群体中的等位基因，要想准确定量还是颇有难度的。QIAGEN的焦磷酸测序技术确保了开展遗传分析时的精确度和准确性，甚至能够检测未知的序列变异。由于焦磷酸测序可以同时获得序列信息和定量信息，因此可评估各种类型的遗传变异，如插入缺失、单核苷酸多态性、单个随机重复及拷贝数变异，还可在单次运行中分析一些连续的序列变异。焦磷酸测序还可进行de novo测序（从头测序），再加上可变位点周围序列所提供的内在对照，成为验证新发现标志物的一种可靠方法。

高分辨率的毛细管电泳技术
我们在实际实验中常常通过凝胶电泳来检测片段以用于基因分析。然而，对于大小相似的片段，手动制胶的分辨率常常不足以区分这些片段。QIAGEN自动化的高分辨率毛细管电泳平台，QIAxcel Advanced System，则克服了这个挑战，为小于500 bp的片段带来了3-5 bp的分辨率。

挑战四：有限的起始材料

在基因分型研究中，我们常常也会遇到另一种窘况，那就是样品有限甚至不够。这可能是因为采样或储存过程中的DNA降解，或仅仅是因为DNA样品的储存时间过长或起始样品珍贵，数量少。

从有限到无限的DNA量
QIAGEN的多重置换扩增（MDA）技术能解决这个问题，它能从少量珍贵的样品中得到大量的全基因组DNA。REPLI-g试剂盒及服务实现了原始DNA的可靠扩增，而无偏向性。扩增后的DNA可直接用于多个应用，如鉴别拷贝数变异的CGH应用。在研究FFPE样品时，DNA片段化也一直让人头疼。QIAGEN提供了REPLI-g FFPE Kit，它使用了一种改良的全基因组扩增方法，而无需预先纯化DNA。

少量的模板DNA也能检测
如果要分析大量的SNP，那么样品材料可能受限。这时，Type-it PCR试剂盒能为您解忧。例如，在利用Type-it Fast SNP Probe PCR Kit开展SNP检测时，即使只有1 ng DNA模板，也能保证高检出率。对于具有挑战性的目标或困难的SNP位点，Type-it Fast SNP Probe PCR Kit则提供了可靠的SNP基因分型，获得了清晰分离的等位基因簇和相同等位基因的严格成簇，确保了高检出率。
 

即使是少量模板，也能获得可靠的SNP基因分型。利用A Type-it Fast SNP Probe PCR Kit或B 来自A供应商的基因分型预混液，对80个不同的基因组DNA（5μl反应，每个10 ng或1 ng）开展等位基因区分。即使是少量模板，Type-it Fast SNP Probe PCR Master Mix的表现也优于A供应商的预混液，提供了等位基因的严格成簇和可靠结果。利用针对芳香烃受体抑制剂基因的TaqMan SNP基因分型分析，在Applied Biosystems 7900HT仪器上开展PCR并分析。黑色：无模板对照；蓝色：T等位基因的杂合子（FAM荧光）；绿色：纯合样品；红色：A等位基因的杂合子（VIC荧光）。数据分析的可信度为98%。

挑战五：数据分析

对于基因分型研究而言，数据分析也不是一件轻松的事。在准确阐释数据时，标准化很重要，在比较不同样品、不同实验及不同实验室的数据时，这一点尤为关键。

轻松的DNA片段分析
正如我们前面所提到的，自动化凝胶电泳平台QIAxcel Advanced System可在3分钟内完成12个样品的DNA片段分析，且手动操作极少，避免了人为失误。与传统的凝胶电泳相比，此系统确保了更高的准确性，为500 bp以下片段带来了3-5 bp的分辨率。

 
准确、高通量的细菌基因分型。通过A QIAxcel Advanced System以原始浓度或B 琼脂糖凝胶电泳以5倍浓度分析样品。通过琼脂糖凝胶电泳以原始浓度（O）、五倍浓度（C），通过QIAxcel Advanced System以原始浓度分析样品3 C和5 D。箭头代表了原先定为阴性的条带。数据是由加拿大公共卫生署食源性人畜共患病的Mutschall及其同事提供的。

强大的软件包
QIAxcel ScreenGel Software是特别为QIAxcel Advanced System开发的，是一种用户友好且强大的数据采集和分析工具。互动的工具简化了分析，并有助于快速的数据阐释。

对于基于HRM的基因分型应用，QIAGEN的Rotor-Gene ScreenClust HRM Software简化了数据分析和阐释。在标准的HRM软件包中，熔解曲线形状和位点的差异被用于区分不同样品。这种方法可能导致不可靠、难以解释的结果，必须再进行耗时的手动数据阐释。相反，Rotor-Gene ScreenClust HRM Software利用新型的算法来鉴别样品，并将它们分成簇。

结语

读到这里，我们已经能把从样品纯化和富集到基于PCR或测序的基因分型分析中遇到的各种挑战分析完毕。有了QIAGEN公司这么多的新型工具，相信您能从容面对基因分型研究中的每一个挑战，轻松获得准确重复的结果。如需基因分型方面的更多资料，请点击此处。