全新的扩增子拯救多重PCR（arm-PCR）技术及其应用——iCubate全自动多重微生物核酸检测系统

美国iCubate公司专利性研发了扩增子拯救多重PCR（arm-PCR）技术，解决了靶点不兼容的问题，并创新性设计了一次性全封闭卡盒及其配套的iCubate 全自动多重微生物核酸检测系统。作为新一代多重分子鉴别诊断平台，iCubate全自动多重微生物核酸检测系统具有多重、自动、封闭、快速、随机、灵敏的技术特点，最多可在一个反应体系内同时检测50个目标分子，能够快速、敏感地检测样品中可能存在的病原体。

针对临床上的某一类症候群的特定病原体筛查，传统检测方法往往需要花费几天甚至更长的时间。而能否在第一时间获得准确的结果，决定了能否把握最佳治疗时机、有效地控制传染病疫情，以及最大程度降低疫情所带来的社会恐慌和经济损失。此时，如果您采用了多重PCR技术，即可在单一反应体系中一次性筛查多个检测对象，节省大量的时间、人力、财力和物力。

为什么多重PCR难以成功？

自1988年首次报道使用以来，多重PCR技术得到了飞速发展，并广泛应用于生物学研究的多个领域，可用于开展病原体筛查、免疫组库多样性研究、遗传性疾病诊断、法医学研究等工作。多重PCR具有明显的技术优势和广阔的应用前景，为什么在二十多年时间里没有充分得到应用呢？

多重PCR技术涉及多个靶标和引物对，而随着反应体系内引物数量的增加，错误引发扩增和引物相互干扰的机会大大增加，表现为多重PCR反应体系内多个分子靶点扩增不兼容、扩增背景过高、可重复性差等问题，其中多个靶点扩增条件不兼容对多重扩增的影响最大。美国iCubate公司创始人——美国HudsonAlpha生物技术研究院研究员、华裔科学家韩健博士曾形象地解释道：“每个靶点都需要两边的引物配合，PCR就像“三条腿赛跑”，成功扩增都需要被捆绑在一起的两个人（一对引物）默契配合。而做多重PCR就需要多对选手同时起跑又同时到达”。

就单靶点反应来说，采用Tm值评价的生物软件所设计的引物，成功率在85%左右。当然通过优化和调节循环温度、氯化镁和 dNTP 浓度等方面，95%左右的靶点能获得成功扩增。可是“优化”工作做得越多，该反应就越“特别”，该靶点能和其它靶点同时扩增的机会就越少。简单计算一下，在不经过优化的前提下，同时能成功扩增5个靶点的几率是0.85×0.85×0.85×0.85×0.85，即仅为44%，这表明同时扩增的靶点越多，多重PCR成功的几率就越小。

iCubate全自动多重微生物核酸检测系统

美国iCubate公司研究开发了革新的扩增子拯救多重PCR技术——arm-PCR，成功解决了靶点不兼容的问题，并创新性设计了一次性全封闭卡盒，以及配套的卡盒处理仪、卡盒阅读仪和控制软件，整合形成现在的iCubate 全自动多重微生物核酸检测系统。同时，该系统还免费提供一个开放性的多重PCR检测试剂开发平台iCubate 2.0（icubate2.com）。

Arm-PCR
作为一种革新的多重PCR技术，扩增子拯救多重PCR（amplicon rescued multiplex PCR，arm-PCR）技术的核心在于首先采用特异性引物扩增富集模版，然后通过分离高浓度引物“拯救”出扩增子，最后通过共用引物来扩增目的片段（如图所示）。整个反应体系在指数增长期使用共用引物进行扩增，所有目标序列的扩增效率基本一致，使得同一反应体系内多个目标基因可以同时进行高效扩增，在一份样品中最多可同时检测50种目标分子的基础上，还可以得到半定量的检测结果。

 
iCubate 2.0开发平台
开放式多重PCR开发平台iCubate 2.0在引物设计中首次引入多聚酶亲和指数（PPI，polymerase preference index）的概念。不仅能解释引物能否和靶点在一定温度下杂交，还从多聚酶亲合性的角度解释了引物扩增成功率的高低，并将所有引物的扩增成功率都提高到95%左右。

卡盒
卡盒内部预先装配了核酸提取、PCR反应和杂交检测所必需的试剂，通过机械移液系统使得液体在不同试剂槽之间转移，实现操作自动化，避免了人为操作导致的试验结果偏差。卡盒采用一次性全封闭设计确保整个检测过程密闭操作，有效避免PCR产物污染实验室环境导致的假阳性问题。

卡盒处理仪
iCubate应用“转换恒温加热头”扩增技术，减少加热块升降温所消耗的时间，加快核酸扩增和杂交反应速度。根据卡盒二维条码和预先加载的驱动程序提供的指令，处理仪的每个独立运转单位能够控制卡盒内的所有操作。1台处理仪可同时检测1~4个样品，最多可串联24台仪器同时检测96个样品。样品随到随做，无需等到一定批量样品后一起上机检测，满足不同检测通量、应用场景和经费限制的需求。

卡盒阅读仪
iCubate应用“转盘”式激光共聚焦扫描系统，适用于Cy3、TAMARA等荧光标记物检测。卡盒阅读仪一次可检测1~4个卡盒，1分钟内在每个检测位点上读取250个数据。单点多次扫描重复性误差<5％，兼顾到检测效率和精确度。

软件系统
iCubate软件系统具有功能强大的样品信息数据管理功能，灵活的试验程序设定方式，可选择不同的核酸提取、扩增、杂交程序，适应实验人员的特定需求。软件能实时监测卡盒在处理仪和阅读仪的工作状态，自动分析检测结果并提供结果报告，实验结果直观易读，方便保存和输出。

配套检测试剂
目前基于iCubate平台已开发出包括呼吸道病原体V组（20种）、呼吸道病原体B组（9种）、 流感病毒分型（8种）、医院获得性感染病原体（14种）、腹泻相关病原体（13种）、STD相关病原体（10种）、分枝菌属（13种）、葡萄球菌（9种）等8个多重PCR检测试剂。

iCubate全自动多重微生物核酸检测系统具有多重、自动、封闭、快速、随机、灵敏等技术特点，适合应用于疾病预防控制机构、出入境检验检疫部门，用于开展病原体筛查、院内感染监测、环境监测、检验检疫工作、食品卫生检验工作，还适用于遗传病基因突变检测、mRNA和miRNA表达图谱研究、免疫组库多样性分析等诸多领域。

2012年起，iCubate全自动多重微生物核酸检测系统在全球上市，获得国际著名的产业咨询机构Frost&Sullivan授予的“新产品创新奖”，并评价为PCR市场新的金标准（http://www.prnewswire.com/news-releases/frost--sullivan-recognizes-icubate-for-developing-the-new-gold-standard-instrument-in-the-pcr-market-143848426.html）。2012年2月，全球第一台iCubate在中国疾病预防控制中心病毒病所安装调试成功。美国iCubate公司授权北京奥科迪医药技术开发有限公司独家代理其在中国疾病预防控制系统内的全部业务。

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